膜電(diàn)位熒光(guāng)探針産品專題（Probes for Membrane Potential）

（線粒體膜電(diàn)位、細胞質膜電(diàn)位）

▶ 快速響應熒光(guāng)探針（Fast-response fluorescent probes）

代表性：ANEP染料，RH染料

▶ 慢(màn)速響應熒光(guāng)探針（Slow-response fluorescent probes）

代表性：短鏈碳菁類染料，JC-1染料，羅丹明123染料，DiBAC染料

專題關鍵詞：

Potentiometric probes 電(diàn)位探針；Membrane Potential 膜電(diàn)位；Hyperpolarization 超極化；Depolarization 去極化；Fast-response 快速響應；Slow-response 慢(màn)速響應；

一(yī)個(gè)細胞典型的質膜跨膜電(diàn)位約為(wèi)70mV（胞内為(wèi)負電(diàn)荷）。膜電(diàn)位的增加和降低(dī)，分别稱為(wèi)膜超極化（Membrane hyperpolarization）和去極化（Membrane depolarization），在許多(duō)生(shēng)理過程中發揮關鍵作用，包括神經沖動的傳播、肌肉收縮、細胞信号和離子通(tōng)道門(mén)控。電(diàn)位探針（Potentiometric probes）是用來研究這些過程的重要工(gōng)具，以及用于線粒體觀察（線粒體的跨膜電(diàn)位約為(wèi)150mV，内部基質呈負電(diàn)荷），用于評估細胞活力，和用于候選新藥的高(gāo)通(tōng)量篩選。

電(diàn)位探針（Potentiometric probes）包括陽離子或兩性苯乙烯染料，陽離子碳花菁和羅丹明，陰離子氧鎓醇。染料的歸類确定因素包括在細胞的聚集方式、反應基制和毒性。根據這些染料的光(guāng)學反應、光(guāng)毒性，與其他分子的相(xiàng)互作用，來選擇合适的電(diàn)位探針滿足特定的用途。根據染料的光(guāng)學反應可将其分為(wèi)兩大類：

一(yī)、快速響應探針（Fast-response probes）

1.1 工(gōng)作原理

快速響應探針（通(tōng)常為(wèi)苯乙烯吡啶鹽染料）通(tōng)過電(diàn)子結構的變化引起熒光(guāng)特征變化來工(gōng)作，對周圍的電(diàn)子場變化做出反應（見(jiàn)圖MK1）。在興奮細胞中其光(guāng)學反應足夠快以檢測瞬時電(diàn)位變化（毫秒(miǎo)ms），包括單一(yī)神經元、心肌細胞和完整大腦(nǎo)。然而，它們電(diàn)位依賴性的熒光(guāng)變化數量級通(tōng)常很小(xiǎo)。快速響應探針通(tōng)常情況每100mV産生(shēng)2-10%的熒光(guāng)變化。

圖MK1. 膜電(diàn)位敏感探針的反應基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速響應探針經曆電(diàn)子場驅動的分子内電(diàn)荷分布變化，從(cóng)而産生(shēng)對應的光(guāng)譜特征或熒光(guāng)強度變化（本圖通(tōng)過顔色标示變化來闡述）。慢(màn)速響應探針是親脂性陰離子（本圖）或陽離子通(tōng)過電(diàn)泳機(jī)制轉跨膜轉運。熒光(guāng)變化與跨膜重新分布相(xiàng)關（本圖通(tōng)過顔色标示變化來闡述），歸因于探針對胞内和胞外環境的敏感性。因此，電(diàn)位反應速度直接體現基礎過程所需的時間常數——電(diàn)子的快速分子内重新分布&完整分子相(xiàng)對較慢(màn)的跨膜運動。

1.2 快速響應探針種類

◇ ANEP染料

ANEP (AminoNaphthylEthenylPyridinium)染料由Leslie Loew和同事(shì)開(kāi)發，是最靈敏的快速響應探針。兩性離子的di-4-ANEPPS（MX4038）和di-8-ANEPPS（MX4039）在各種組織、細胞和模型膜系統中表現出相(xiàng)當一(yī)緻的熒光(guāng)變化速率（10%熒光(guāng)變化/100mV）。ANEP染料毫秒(miǎo)級的時間特征彌補其中等響應振幅（見(jiàn)圖MK2）。di-4-ANEPPS（MX4038）非常快速被細胞内在化，阻止其用在除極短期實驗之外的應用中，然而，di-8-ANEPPS（MX4039）能(néng)更好的保留在質膜的外層。另外，雖然兩種染料都具有良好的光(guāng)穩定和低(dī)毒性，報(bào)道提及di-8-ANEPPS（MX4039）比di-4-ANEPPS（MX4038）具微好的光(guāng)穩定性和顯著更低(dī)的光(guāng)毒性。

與其他的苯乙烯染料相(xiàng)似，ANEP染料在水(shuǐ)溶性溶液内基本無熒光(guāng)，呈現的光(guāng)譜特征強烈取決于所處環境。與磷脂小(xiǎo)體結合後，di-8-ANEPPS（MX4039）最大吸收/發射波長(cháng)約為(wèi)467/631nm，相(xiàng)對在甲醇内的最大激發/發射約為(wèi)498/713nm。di-4-ANEPPS（MX4038）結合到(dào)神經膜的最大激發/發射波長(cháng)約為(wèi)475/617nm。

di-8-ANEPPS（MX4039）和di-4-ANEPPS（MX4038）兩者皆對膜電(diàn)位（超極化）增加做出響應，~440nm激發處熒光(guāng)降低(dī)，而530nm處激發熒光(guāng)增加。這些光(guāng)譜的遷移允許使用比率法來關聯化膜電(diàn)位與熒光(guāng)信号變化。

圖MK2. 使用快速響應探針di-4-ANEPPS檢測兔完整心髒的動作電(diàn)位（Detection of action potentials in intact rabbit hearts using the fast potentiometric probe di-4-ANEPPS）。Excised rabbit hearts were loaded with di-4-ANEPPS by perfusion with dye-containing medium. Fluorescence was excited at 488 nm by an argon-ion laser. Emission components at 540 ± 6 nm (green) and >610 nm (red) were detected simultaneously by two photomultipliers (panel A). The ratio of the green to red signals (panel B) displayed a larger fractional change during action potential cycles than either of the component signals; it also followed transmembrane voltage contours recorded simultaneously by an intracellular microelectrode (panel C). In addition, fluorescence ratio measurements reduce the motion artifacts that typically distort optical signals detected from contracting hearts. Figure reproduced with permission from Am J Physiol Heart Circ Physiol (2000) 279:H1421.

◇ RH染料

最先由Rina Hildesheim合成，RH染料包含一(yī)系列dialkylaminophenylpolyenylpyridinium染料，主要用于神經元的功能(néng)成像。大量RH染料類似物(wù)的存在反映一(yī)種現象就(jiù)是沒有一(yī)種單一(yī)染料能(néng)提供所有實驗條件(jiàn)需要的光(guāng)學反應。目前，最廣泛使用的RH染料是RH 237（MX4017）、RH 414（MX4019）、RH 421（MX4018）和RH 795（MX4020）。不同類似物(wù)染色的生(shēng)理效應并非完全相(xiàng)同。例如，用RH 414（MX4019）染大腦(nǎo)皮層引起動脈收縮，用RH 795（MX4020）則不會(huì)。體外對海馬腦(nǎo)片或體内對貓和猴子視覺皮質（單細胞記錄）進行檢測，RH795産生(shēng)可忽略的副反應。

與ANEP染料相(xiàng)似，RH染料對膜電(diàn)位變化做出反應，産生(shēng)可變程度的熒光(guāng)激發和發射光(guāng)譜遷移。它們的吸收和熒光(guāng)光(guāng)譜也強烈取決于所處環境。RH414結合到(dào)磷脂小(xiǎo)體上(shàng)的光(guāng)譜類似于神經元質膜上(shàng)的。結合使用RH染料和熒光(guāng)鈣離子指示劑允許同時對膜電(diàn)位（RH237,MX4017）和胞内鈣離子（Rhod-2 AM，MX4507）進行心肌單細胞層的成像檢測。

1.3 懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）快速響應探針特征和應用彙總

1.4 懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）快速響應探針産品信息

二、慢(màn)速響應探針（Slow-response probes）

2.1 工(gōng)作原理

慢(màn)速響應探針根據跨膜分布表現出電(diàn)位依賴的變化，随之是熒光(guāng)的變化（見(jiàn)圖MK1）。

圖MK1. 膜電(diàn)位敏感探針的反應基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速響應探針經曆電(diàn)子場驅動的分子内電(diàn)荷分布變化，從(cóng)而産生(shēng)對應的光(guāng)譜特征或熒光(guāng)強度變化（本圖通(tōng)過顔色标示變化來闡述）。慢(màn)速響應探針是親脂性陰離子（本圖）或陽離子通(tōng)過電(diàn)泳機(jī)制轉跨膜轉運。熒光(guāng)變化與跨膜重新分布相(xiàng)關（本圖通(tōng)過顔色标示變化來闡述），歸因于探針對胞内和胞外環境的敏感性。因此，電(diàn)位反應速度直接體現基礎過程所需的時間常數——電(diàn)子的快速分子内重新分布&完整分子相(xiàng)對較慢(màn)的跨膜運動。

2.2 慢(màn)速響應探針種類

◇ 碳花菁染料（DiI, DiS and DiO Derivatives）

帶短烷基尾（<7個(gè)碳原子）的DiI，DiS和DiO屬于第一(yī)代開(kāi)發的電(diàn)位熒光(guāng)探針。這些陽離子染料聚集在超極化的膜上(shàng)，然後轉運進入脂質雙分子層。聚集進入封閉的膜内部通(tōng)常引起降低(dī)的熒光(guāng)，雖然變化幅度和熒光(guāng)反應的方向強烈取決于染料濃度和染料的結構特征。

DiOC6(3) (MX4009) 是最廣泛使用的膜電(diàn)位測定用碳花菁染料，緊随其後的是DiOC5(3) (MX4032) 。流式測定中，碳花菁熒光(guāng)強度的測定不僅取決于膜電(diàn)位，也受細胞大小(xiǎo)影響。某些情況下(xià)，前散射熒光(guāng)的測定通(tōng)常用來标準化細胞大小(xiǎo)變量引起的光(guāng)學變量。熒光(guāng)比率法采用DiOC2(3) (MX4008) 在發射光(guāng)譜内的電(diàn)位依賴紅(hóng)光(guāng)遷移來測定細菌膜電(diàn)位（見(jiàn)圖MK3）。碳花菁染料，特别是thiacyanines（比如DiSC3(5)，MX4033 ），能(néng)抑制呼吸，因此可能(néng)具有相(xiàng)對細胞毒性。

圖MK3. 金黃色葡萄球菌菌群經30µM DiOC2(3)染色的雙色流式分析圖（Two-color flow cytometric analysis of Staphylococcus aureus populations stained with 30 µM DiOC2(3) in the presence (red) or absence (blue) of the metabolic uncoupler CCCP. N ote the variability (~100-fold range) of the green and red fluorescence intensities. B) The same data expressed as red/green fluorescence intensity ratios. Ratio values are calculated by subtracting the logarithmic green fluorescence channel value from the corresponding logarithmic red fluorescence channel value.

◇ JC-1和JC-10

JC-1 (MX3203)在低(dī)濃度或低(dī)膜電(diàn)位下(xià)呈綠色熒光(guāng)單體，然而，在更高(gāo)濃度（水(shuǐ)溶性濃度＞0.1uM）或更高(gāo)電(diàn)位，形成紅(hóng)色熒光(guāng)的J-聚集體（J-aggregates），具寬激發光(guāng)譜和非常窄的發射光(guāng)譜。由于J-聚集體形成的增加與一(yī)定範圍内（30-180mV）膜電(diàn)位的變化呈線性關系，這一(yī)現象則可被電(diàn)位測定所采用（見(jiàn)MK4 JC-1工(gōng)作原理示意圖）。相(xiàng)對于質膜，JC-1更特異性識别線粒體膜電(diàn)位。比其他的陽離子染料比如DiOC6(3)和羅丹明123，去極化響應的持續性更好。

各種類型的比率測定都可進行，通(tōng)過組合綠色熒光(guāng)JC-1單體（Ex/Em~514/529nm）和紅(hóng)色熒光(guāng)J-聚集體（Ex/Em~585/590nm），後者能(néng)在485nm-最大吸收波長(cháng)的範圍内被有效激發。用于檢測熒光(guāng)素（FITC）和四甲基羅丹明的光(guāng)學濾片能(néng)分别用來檢測單體和聚集體形式。另外，兩種形式能(néng)同時用熒光(guāng)素長(cháng)通(tōng)光(guāng)學濾片設置來檢測。對于流式檢測，JC-1能(néng)用488nm激發，通(tōng)過二元模式分别用綠色通(tōng)道檢測單體和紅(hóng)色通(tōng)道檢測J-聚集體。

JC-1普遍用于檢測凋亡細胞的線粒體去極化（JC-1線粒體膜電(diàn)位檢測試劑盒，MX3204-100T）和分析多(duō)藥耐藥細胞。也常用來評估基于細胞高(gāo)通(tōng)量測定的線粒體功能(néng)評估。JC-10是JC-1的升級版本，熒光(guāng)特征類似于JC-1，探針本身具更好的水(shuǐ)溶性。

圖MK4. JC-1進入線粒體和生(shēng)成J-聚集體的示例流程圖（Schematic illustration depicting JC-1 entry into the mitochondria and the generation of J aggregate）。JC-1，陽離子碳菁類染料（綠色）以膜電(diàn)位依賴形式聚集在線粒體并開(kāi)始形成J-聚集體（紅(hóng)色）。當發生(shēng)去極化，仍保持單體形式，呈綠色熒光(guāng)。（文獻來源：Sivandzade F et al. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. Bio Protoc. 2019 Jan 5;9(1). PMID: 30687773）

◇ Rhodamine 123, TMRM and TMRE

羅丹明123（MX3208）普遍用做線粒體的結構标志(zhì)物(wù)和線粒體活性的指示劑。

TMRM（MX4306）和TMRE（MX4305）分别是四甲基羅丹明的甲酯和乙酯形式，結構非常類似于羅丹明123。主要用作線粒體膜電(diàn)位感應器(qì)。與羅丹明123（MX3208）一(yī)樣，這些陽離子染料聚集在線粒體，由于自(zì)淬滅熒光(guāng)減弱。TMRM（MX4306）和TMRE（MX4305）比羅丹明123能(néng)更快的穿過質膜，它們的強熒光(guāng)允許使用低(dī)濃度的探針，從(cóng)而避免探針聚集。大鼠心肌細胞，TMRM（MX4306）與X-rhod-1 AM同時使用共聚焦成像線粒體膜電(diàn)位和鈣離子。活細胞内TMRE（MX4305）成功用于高(gāo)通(tōng)量篩選影響線粒體膜電(diàn)位的藥物(wù)。

◇ DiBAC（Bis-Oxonols）

三種雙巴比妥酸氧鎓醇，通(tōng)常統稱為(wèi)DiBAC染料，形成一(yī)個(gè)光(guāng)譜與衆不同的的電(diàn)位探針家族，最大激發波長(cháng)約為(wèi)490nm（DiBAC4(3) (MX4029) ），530nm（DiSBAC2(3) (MX4030)）和590nm（DiBAC4(5) (MX4031) ）。有幾篇文章簡單定義這些染料為(wèi)雙氧鎓醇（bis-oxonol），則總是很難确定到(dào)底用的是哪一(yī)種染料。不過，大量使用雙氧鎓醇（bis-oxonol）的文章使用的主要為(wèi)DiBAC4(3) (MX4029)。

這些染料進入去極化細胞，與胞内蛋白(bái)或膜結合，表現處熒光(guāng)增強和紅(hóng)光(guāng)遷移。去極化越高(gāo)，内流進入細胞的陰離子染料越多(duō)，則熒光(guāng)增加。相(xiàng)反，超極化随之而來的是熒光(guāng)降低(dī)（圖MK5）。與陽離子碳菁類染料相(xiàng)反，陰離子雙氧鎓醇大體被線粒體排斥，主要對細胞質膜電(diàn)位敏感。DiBAC4(3) (MX4029)産生(shēng)的電(diàn)位依賴熒光(guāng)變化典型為(wèi)~1%/mV。陰離子氧鎓醇和陽離子K+-缬氨黴素複合體之間的相(xiàng)互作用使得在校準電(diàn)位反應時用此離子載體變得複雜(zá)化。氧鎓醇類染料對各種離子通(tōng)道和受體呈現出已知的藥理活性。因此，在使用這些熒光(guāng)探針的任何實驗的情況下(xià)，都需要确定實驗本身得到(dào)的生(shēng)理效應與外用加入探針濃度是無關聯的，這一(yī)步驟十分重要。

圖MK5. Detection of ATP-sensitive potassium (KATP) channel activation in isolated capillaries from guinea pig hearts using DiBAC4(3), a slow potentiometric probe. Application of a K+ channel opener (HOE 234) induced membrane hyperpolarization, resulting in a net efflux of intracellular DiBAC4(3), which is registered as a decrease of fluorescence intensity. These effects were reversed by subsequent treatment with the channel blocker glibenclamide.（文獻來源：Langheinrich U et al. Hyperpolarization of isolated capillaries from guinea-pig heart induced by K+ channel openers and glucose deprivation. J Physiol. 1997 Jul 15;502 ( Pt 2):397-408. PMID: 9263919）

2.3 懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）慢(màn)速響應探針特征和應用彙總

2.5 懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）慢(màn)速響應探針産品信息

相(xiàng)關産品（電(diàn)位探針校準用）

—Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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