JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

（JC-1線粒體膜電(diàn)位檢測試劑盒）

溫馨提示1）：見(jiàn)我司懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）整理的線粒體熒光(guāng)探針産品專題。

溫馨提示2）：見(jiàn)我司懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）整理的膜電(diàn)位檢測探針産品專題。

産品标簽

Rhodamine 123 羅丹明123；JC-1；JC-10；CCCP；CAS：62669-70-9

産品信息

産品描述

JC-1線粒體膜電(diàn)位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一(yī)種以JC-1為(wèi)熒光(guāng)探針，快速且靈敏的檢測細胞、組織或純化線粒體膜電(diàn)位變化的試劑盒。因線粒體膜電(diàn)位的下(xià)降是細胞凋亡早期的一(yī)個(gè)标志(zhì)性事(shì)件(jiàn)。因此本試劑盒可用于早期的細胞凋亡檢測。

JC-1是一(yī)種廣泛用于檢測線粒體膜電(diàn)位△Ψm位的理想熒光(guāng)探針。JC-1染料以電(diàn)勢依賴性的方式積聚在線粒體内，可以用來檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電(diàn)位。正常線粒體内，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物(wù)，聚合物(wù)發出強烈的紅(hóng)色熒光(guāng)（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電(diàn)位的下(xià)降或喪失，JC-1隻能(néng)以單體的形式存在于胞漿中，産生(shēng)綠色熒光(guāng)（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1不僅可用于定性檢測，因顔色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電(diàn)位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通(tōng)過紅(hóng)/綠熒光(guāng)強度的比例來衡量。

本試劑盒提供CCCP用作線粒體膜電(diàn)位喪失的陽性對照(zhào)。對于六孔闆樣品，本試劑盒可檢測100個(gè)樣品。

産品包裝

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年(nián)有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）  JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低(dī)溫度情況下(xià)會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋内，可以20～25℃水(shuǐ)浴溫育片刻至全部融解後使用。

2）  裝載完JC-1後用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時洗滌效果較好。

3）  JC-1探針裝載完并洗滌後盡量在30min内完成後續檢測。在檢測前需冰浴保存。

4）  請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。

5）  如果發現JC-1染色緩沖液（5×）中有沉澱，必須全部溶解後才能(néng)使用，可在37℃加熱促進溶解。

6）  CCCP為(wèi)線粒體電(diàn)子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小(xiǎo)心防護。

7）  為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

1.  JC-1染色工(gōng)作液制備

對于六孔闆，每孔所需JC-1染色工(gōng)作液的量為(wèi)1ml，其他培養器(qì)皿的JC-1染色工(gōng)作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mL JC-1染色工(gōng)作液。

取适量JC-1（200×），按照(zhào)每50μL JC-1（200×）加入8mL超純水(shuǐ)的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然後再加入2mL JC-1染色緩沖液（5×），混勻後即為(wèi)JC-1染色工(gōng)作液。

【注意】：必須先把JC-1（200×）用超純水(shuǐ)（試劑盒提供）充分溶解混勻後，才可加入JC-1染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1會(huì)很難充分溶解，會(huì)嚴重影響後續的檢測。

2.  陽性對照(zhào)的設置

CCCP（10mM）推薦按1∶1000的比例加入到(dào)細胞培養液中，稀釋至10μM，處理細胞20min。随後按照(zhào)下(xià)述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電(diàn)位的檢測。

對于大多(duō)數細胞，通(tōng)常10μM CCCP處理20 min後線粒體的膜電(diàn)位會(huì)完全喪失，JC-1染色後觀察應呈綠色熒光(guāng)；而正常的細胞經JC-1染色後應顯示紅(hóng)色熒光(guāng)。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能(néng)有所不同，需自(zì)行參考相(xiàng)關文獻資料決定。

3.  對于懸浮細胞

1）  取10～60萬細胞，重懸于0.5mL細胞培養液中，細胞培養液中可以含血清和酚紅(hóng)。

2）  加入0.5mL JC-1染色工(gōng)作液，颠倒數次混勻。細胞培養箱中37℃孵育20min。

3）  孵育期間，按照(zhào)每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水(shuǐ)的比例，配制适量的JC-1染色緩沖液（1×），并放(fàng)置于冰浴。

4）  37℃孵育結束後，600×g4℃離心3～4min沉澱細胞。棄上(shàng)清，注意盡量不要吸除細胞。

5）  用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心3～4min沉澱細胞，棄上(shàng)清。再加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心3～4min沉澱細胞，棄上(shàng)清。

6）  再用适量JC-1染色緩沖液（1×）重懸後，用熒光(guāng)顯微鏡或激光(guāng)共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計檢測或流式細胞儀分析。

4.  對于貼壁細胞

【注意】：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸後參考懸浮細胞的方法進行檢測。

1）  對于六孔闆的一(yī)個(gè)孔，吸除培養液，根據具體實驗如有必要可用PBS或其它适當溶液洗滌細胞一(yī)次，加入1mL細胞培養液。細胞培養液中可以含有血清和酚紅(hóng)。

2）  加入1mL JC-1染色工(gōng)作液，充分混勻。細胞培養箱中37℃孵育20min。

3）  孵育期間，按照(zhào)每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水(shuǐ)的比例，配制适量的JC-1染色緩沖液（1×），并放(fàng)置于冰浴。

4）  37℃孵育結束後，吸除上(shàng)清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。

5）  加入2mL細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅(hóng)。

6）  熒光(guāng)顯微鏡或激光(guāng)共聚焦顯微鏡下(xià)觀察。

5.  對于純化的線粒體

1）  将配制好的JC-1染色工(gōng)作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5倍。

2）  0.9mL 5倍稀釋的JC-1染色工(gōng)作液中加入0.1mL總蛋白(bái)量為(wèi)10～100μg純化的線粒體。

3）  用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計或熒光(guāng)酶标儀檢測：混勻後直接用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計進行時間掃描（time scan），激發波長(cháng)為(wèi)485nm，發射波長(cháng)為(wèi)590nm。如果使用熒光(guāng)酶标儀，激發波長(cháng)不能(néng)設置為(wèi)485nm時，可在475～520nm範圍内設置激發波長(cháng)。另外，也可以參考下(xià)面步驟6中的波長(cháng)設置進行熒光(guāng)檢測。

4）  用熒光(guāng)顯微鏡或激光(guāng)共聚焦顯微鏡觀察：方法同下(xià)面的步驟6。

6.  熒光(guāng)觀測和結果分析

檢測JC-1單體時可以把激發光(guāng)設置為(wèi)490nm，發射光(guāng)設置為(wèi)530nm；檢測JC-1聚合物(wù)時，可以把激發光(guāng)設置為(wèi)525nm，發射光(guāng)設置為(wèi)590nm。

【注1】：此處測定熒光(guāng)時不必把激發光(guāng)和發射光(guāng)設置在最大激發波長(cháng)和最大發射波長(cháng)。如使用熒光(guāng)顯微鏡觀察，檢測JC-1聚合物(wù)時可使用常來檢測碘化丙啶或者Cy3用的标準帶通(tōng)濾波器(qì)。檢測JC-1單體可使用常來檢測FITC或GFP的标準帶通(tōng)濾波器(qì)。出現綠色熒光(guāng)說明線粒體膜電(diàn)位下(xià)降，并且該細胞很可能(néng)處于細胞凋亡早期。出現紅(hóng)色熒光(guāng)說明線粒體膜電(diàn)位比較正常，細胞的狀态也比較正常。

相(xiàng)關産品：

 — — Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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