活體成像研究底物(wù)之：
Firefly D-Luciferin D-蟲熒光(guāng)素（Luc基因）
（活體成像研究/體外生(shēng)物(wù)發光(guāng)研究/轉錄水(shuǐ)平研究）
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【重要提示】： |
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1）見(jiàn)我司懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）整理的活體成像研究底物(wù)之：腔腸素（Coelenterazine）産品專題； |
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3）見(jiàn)我司懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）整理的D-熒光(guāng)素（D-luciferin）常見(jiàn)問題； |
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4）見(jiàn)我司懋康生(shēng)物(wù)（MKBio）整理的D-熒光(guāng)素（D-luciferin）體外使用指南(nán)；敬請期待。。。。 |
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搜索關鍵詞：
Luc reporter gene 報(bào)告基因；Luciferase 螢火蟲熒光(guāng)素酶；In vivo imaging 活體成像研究；熒光(guāng)素酶/ATP水(shuǐ)平研究；報(bào)告基因質粒；報(bào)告基因病毒顆粒；螢火蟲熒光(guāng)素；甲蟲熒光(guāng)素；CAS：103404-75-7；
基本描述：
D-熒光(guāng)素（D-Luciferin）是熒光(guāng)素酶（Luciferase）的常用底物(wù)，普遍用于整個(gè)生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域，特别是體内活體成像技(jì)術(shù)。作用機(jī)制是在ATP和熒光(guāng)素酶的作用下(xià)，D-熒光(guāng)素（底物(wù)）被氧化發光(guāng)。當熒光(guāng)素過量時，産生(shēng)的光(guāng)量子數與熒光(guāng)素酶的濃度呈正相(xiàng)關性（見(jiàn)下(xià)圖）。将攜帶熒光(guāng)素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染進入細胞後，導入研究動物(wù)如大小(xiǎo)鼠體内，之後注入熒光(guāng)素，通(tōng)過生(shēng)物(wù)發光(guāng)成像技(jì)術(shù)（BLI）來檢測光(guāng)強度變化，從(cóng)而實時監測疾病發展狀态或藥物(wù)的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生(shēng)物(wù)發光(guāng)強度的變化來指示能(néng)量或生(shēng)命體征。
基本應用：
1）體内活體成像In vivo imaging；熒光(guāng)素酶标記的腫瘤細胞、幹細胞或傳染疾病通(tōng)常注射入研究動物(wù)模型比如大小(xiǎo)鼠内進行研究，從(cóng)而對動物(wù)模型進行實時和非侵略性的監測疾病進程和/或藥效。
2）體外研究，包括熒光(guāng)素酶和ATP水(shuǐ)平分析；報(bào)告基因分析；高(gāo)通(tōng)量測序和各種污染檢測。
常見(jiàn)商業(yè)化類型的差異（熒光(guāng)素鉀，鈉，遊離酸）：
目前市(shì)場上(shàng)常見(jiàn)的有三種産品形式，D-熒光(guāng)素（遊離酸），D-熒光(guāng)素（鈉鹽），和D-熒光(guāng)素（鉀鹽）。這三種産品主要差别在于溶解特性。
1）D-熒光(guāng)素（遊離酸）在水(shuǐ)以及緩沖體系内的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。
2）D-熒光(guāng)素（鈉鹽）和D-熒光(guāng)素（鉀鹽）能(néng)夠非常容易且快速的溶入水(shuǐ)或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特别适合體内實驗。配成溶液後的三種産品，在絕大多(duō)數應用上(shàng)都沒有實質性的差别。
3）D-熒光(guāng)素（鈉鹽）和D-熒光(guāng)素（鉀鹽）基本上(shàng)沒有差别，主要是使用習慣等因素影響。整體來看(kàn)，鉀鹽的應用文獻明顯多(duō)于鈉鹽。
使用方法【體内成像/腹腔注射】
一(yī)． 儲存液制備（Luciferin preparation）
1.1 将D-熒光(guāng)素鉀鹽（或D-熒光(guāng)素鈉鹽）凍幹粉回至室溫，溶于DPBS（無鈣/鎂）使其終濃度為(wèi)15mg/ml。
1.2 用0.22μm濾膜過濾除菌，條件(jiàn)許可現配現用。若單次實在用不完，則分裝後置于≤-20℃保存，避免反複凍融。一(yī)旦使用，放(fàng)到(dào)4℃解凍，保持冰冷且避光(guāng)。
二．動力學曲線建立（Kinetic curve）
由于D-熒光(guāng)素進入體内的生(shēng)物(wù)分布非常快速且動力學具組織依賴性，因此，研究人員(yuán)需正式實驗前确定自(zì)身動物(wù)在D-熒光(guāng)素注射後的成像采集最佳時間。通(tōng)過建立動物(wù)模型的熒光(guāng)素酶動力學曲線來完成。
D-熒光(guāng)素給藥的方式有腹腔注射（ip）、靜(jìng)脈注射（iv）或皮下(xià)注射（sc），通(tōng)常給藥方式為(wèi)腹腔和靜(jìng)脈。以下(xià)以腹腔注射為(wèi)例。
2.1 如下(xià)腹腔注射（i.p.）D-熒光(guāng)素。如果給藥前需麻醉小(xiǎo)鼠，需要注意此步操作可能(néng)稍微延長(cháng)動力學（熒光(guāng)素酶峰值表達時間）。
2.2 a）如果在動物(wù)保持清醒時給藥，等待三分鍾，之後按照(zhào)所選方法麻醉動物(wù)（氣化或注射麻醉）。b）将麻醉後動物(wù)置于成像室内，給藥後約5min開(kāi)始第一(yī)次拍照(zhào)。
2.3 對于腹腔注射模型，每5-10min（最長(cháng)達40-60min）拍一(yī)次照(zhào)以建立熒光(guāng)素酶表達的動力學曲線。【大多(duō)數注射麻醉藥持續20-30min，要完成一(yī)次完整的動力學研究可能(néng)需要再給一(yī)次麻醉藥物(wù)。使用2%異氟烷氣體麻醉健康動物(wù)能(néng)在活體成像系統如IVIS内安全放(fàng)置45min。】
2.4 根據模型建立的動力學曲線選擇最佳時間點采集圖像。【許多(duō)模型研究表明腹腔或皮下(xià)注射後約10-20min達到(dào)信号峰值，靜(jìng)脈注射後約2-5min達到(dào)信号峰值。】
三．腹腔注射（i.p.）技(jì)術(shù)要點
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最佳注射點（Preferred site） |
動物(wù)左下(xià)腹部（lower left abdominal quadrant） |
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針頭大小(xiǎo)（Needle size） |
25 gauge，通(tōng)常與1ml（1 cc）注射器(qì)配套使用 |
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體積（Volume） |
每10g體重小(xiǎo)鼠加入100μl 15mg/ml D-熒光(guāng)素，相(xiàng)當于150mg/kg的給藥劑量。【腹腔單次注射1ml無刺激性溶液對動物(wù)無任何壓力】。 |
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動物(wù)位置（Position of animal）： |
手動固定，背卧位（腹部向上(shàng)），動物(wù)顱（頭部）朝下(xià)。輕輕晃動小(xiǎo)鼠2-3次使得腸道向下(xià)移動，在下(xià)腹區域創造一(yī)個(gè)空腔。 |
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注射（Injection）： |
Needle should be bevel-side up and slightly angled when entering the abdominal cavity. Penetrate just through abdominal wall (about 4-5mm). The tip of the needle should just penetrate the abdominal wall of the animal’s left lower abdominal quadrant. |
應用示例【生(shēng)物(wù)化學發光(guāng)體内成像】
Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.
Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained
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貨号 |
産品名稱 |
規格 |
價格（元） |
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MX4602-100MG |
100mg |
998 |
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MX4602-500MG |
500mg |
2500 |
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MX4602-1G |
1g |
4500 |
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MX4603-100MG |
100mg |
998 |
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MX4603-500MG |
500mg |
2500 |
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MX4603-1G |
1g |
4500 |
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MX4601-250MG |
250mg |
1800 |
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MX4601-500MG |
500mg |
3000 |
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MX4601-1000MG |
1g |
5800 |
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MX4604-10MG |
10mg |
1350 |
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MX4604-50MG |
50mg |
5440 |
注意事(shì)項
1） 我司懋康生(shēng)物(wù)（MKBIO）提供所有産品僅作科研用途，請不要用于臨床或診療用途。
2） 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。
附錄I 各種給藥途徑和模型動物(wù)的建議位點、針頭大小(xiǎo)和注射體積
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給藥途徑 |
倉鼠 |
小(xiǎo)鼠 |
大鼠 |
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IM肌肉注射 |
位點 體積 大小(xiǎo) |
Quadriceps, gluteals ≤0.15 ml ＜23 gauge |
Quadriceps ≤0.03 ml ＜23 gauge |
Quadriceps, gluteals, triceps ≤0.25 ml ＜22 gauge |
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IP腹腔注射 |
位點 體積 大小(xiǎo) |
Lower right quadrant of abdomen ≤3 ml ＜21 gauge |
Lower right quadrant of abdomen ≤2 ml ＜25 gauge |
Lower right quadrant of abdomen ≤5 ml ＜22 gauge |
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IV靜(jìng)脈注射 |
位點 體積 大小(xiǎo) |
Not recommended |
Lateral tail veins ≤0.5 ml ＜27 gauge |
Lateral tail or saphenous veins ≤2 ml slowly ＜22 gauge |
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Intragastric 灌胃 |
位點 體積 大小(xiǎo) |
Stomach N/A 18-22 gauge, 4-4.5cm long, Bulbed feeding needle |
Stomach 5-10ml/kg 18-22 gauge, 2-3cm long, Bulbed feeding needle |
Stomach 5-10ml/kg 15-18 gauge, 6-8cm long, Bulbed feeding needle or 8 French flexible catheter |
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SC皮下(xià)注射 |
位點 體積 大小(xiǎo) |
Neck, back ≤3 ml ＜21 gauge |
Neck, back ≤1 ml ＜22 gauge |
Neck, back，abdomen ≤5 ml ＜21 gauge |
— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】
上海夢澤生物科技有限公司是一(yī)家涉足于生(shēng)命科學和生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域研究的試劑、儀器(qì)和實驗室消耗品與實驗服務工(gōng)作，主要從(cóng)事(shì)細胞生(shēng)物(wù)學、植物(wù)學、分子生(shēng)物(wù)學、免疫學、生(shēng)物(wù)化學、蛋白(bái)組學。生(shēng)物(wù)制藥與診斷試劑研發生(shēng)産等領域。 本公司秉承“以人為(wèi)本，以誠為(wèi)信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為(wèi)廣大客戶提供優質産品。
