D-luciferin D-熒光(guāng)素/D-熒光(guāng)素鉀鹽/D-熒光(guāng)素鈉鹽常見(jiàn)問題

1. D-熒光(guāng)素（D-luciferin）适合用于哪些實驗？

作為(wèi)螢火蟲熒光(guāng)素酶（Firefly luciferase）的作用底物(wù)，常常用于以下(xià)實驗，

1）  體内活體成像In vivo imaging；熒光(guāng)素酶标記的腫瘤細胞、幹細胞或傳染疾病通(tōng)常注射入研究動物(wù)模型比如大小(xiǎo)鼠内進行研究，從(cóng)而對動物(wù)模型進行實時和非侵略性的監測疾病進程和/或藥效。

2）  體外研究In vitro study，包括熒光(guāng)素酶和ATP水(shuǐ)平分析；報(bào)告基因分析；高(gāo)通(tōng)量測序和各種污染檢測。

2. D-熒光(guāng)素（D-luciferin）的作用原理如何？

作用機(jī)制：在ATP和熒光(guāng)素酶的作用下(xià)，D-熒光(guāng)素（底物(wù)）被氧化發光(guāng)。當熒光(guāng)素過量時，産生(shēng)的光(guāng)量子數與熒光(guāng)素酶的濃度呈正相(xiàng)關性（見(jiàn)下(xià)圖）。

機(jī)理闡釋（體内）：熒光(guāng)素酶（Luc）催化底物(wù)D-熒光(guāng)素，利用ATP和Mg2+作為(wèi)輔因子，氧氣存在下(xià)發射一(yī)典型的黃綠光(guāng)，之後在體内37℃下(xià)遷移到(dào)紅(hóng)光(guāng)。

機(jī)理闡釋（體外）：很多(duō)因素都可能(néng)影響反應靈敏性，包括溫度、pH或底物(wù)濃度。建議使用pH 7.8的緩沖液，并且使用前将所有試劑預熱到(dào)室溫。建議反應緩沖液内添加過量的ATP和Mg2+以達到(dào)最佳反應狀态。

3. 甲蟲熒光(guāng)素（Beetle luciferin）和熒光(guāng)蟲熒光(guāng)素（Firefly luciferin）之間有差别？

兩者之間沒有差别，僅是不同公司命名上(shàng)的差異，化學結構一(yī)緻。

4. 熒光(guāng)素（luciferin）如何溶解，穩定性如何？

很多(duō)文獻和一(yī)些客戶提及用水(shuǐ)溶解D-熒光(guāng)素，之後置于-80℃分裝凍存，基本沒有明顯毒性效應。鉀鹽溶解性通(tōng)常是60mg/ml，而鈉鹽溶解性高(gāo)達100mg/ml（遊離酸不溶于水(shuǐ)，但溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml）。但是，關于溶解的D-熒光(guāng)素穩定性存在争議報(bào)道，可能(néng)由于水(shuǐ)中含有的氧氣而破壞穩定性。最好将D-熒光(guāng)素溶于無氣水(shuǐ)（degassed H2O），保存效果最佳。

對最靈敏的實驗，然而，強烈建議使用新鮮配制的反應液以降低(dī)實驗中的可變性（比如，低(dī)濃度酶或次優溫度或次優鹽離子濃度可能(néng)需要高(gāo)濃度底物(wù)來驅動反應完全進行）。

5. D-熒光(guāng)素鉀鹽和D-熒光(guāng)素鈉鹽之間有差别？

兩者之間基本無差别，可能(néng)在物(wù)理特性上(shàng)有些小(xiǎo)差别，比如D-熒光(guāng)素鈉鹽有點更顆粒狀和水(shuǐ)溶性更由于鉀鹽。另外，從(cóng)報(bào)道文獻來看(kàn)約3倍多(duō)的文獻用鉀鹽，許多(duō)研究者體内更傾向于鉀鹽，但任何一(yī)種效果一(yī)緻。

6. D-熒光(guāng)素鉀鹽/鈉鹽和D-熒光(guāng)素遊離酸之間有差别？

D-熒光(guāng)素遊離酸不溶于水(shuǐ)，除非溶于稀堿比如NaOH或KOH調整過pH的水(shuǐ)。溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml。然而，D-熒光(guāng)素鉀鹽或鈉鹽在實驗中使用更方便，特别是體内成像，由于很容易溶于水(shuǐ)或緩沖液，對檢測系統的毒性更低(dī)。

7. 為(wèi)什麽D-熒光(guāng)素鉀鹽/鈉鹽要溶于無Ca2+或Mg2+的PBS？其他鹽溶液能(néng)用于溶解D-熒光(guāng)素鉀鹽/鈉鹽?

PBS，或磷酸緩沖鹽和DPBS都是生(shēng)物(wù)學研究的常用緩沖鹽，通(tōng)常用于細胞相(xiàng)關的研究中。PBS/DPBS是等滲緩緩沖液（比如與人身體兼容）。這些緩沖液專門(mén)設計能(néng)提供和維持穩定pH 7.2-7.6。PBS和DPBS之間沒差别，雖然後者無Ca2+/ Mg2+。鈣鎂溶液可能(néng)會(huì)限制胰酶活性。另外，Mg2+是催化D-熒光(guāng)素生(shēng)成氧化熒光(guāng)素的關鍵成分（而Ca2+以相(xiàng)似的活性參與腔腸素催化）。其他鹽溶液可能(néng)用來溶解D-熒光(guāng)素，隻要存在的陽離子不會(huì)幹擾實驗結果或産生(shēng)脫靶效應。

8. D-熒光(guāng)素在體内如何分布？

D-熒光(guāng)素注射入動物(wù)體内後能(néng)快速分布且很容易分散到(dào)全身。

9. D-熒光(guāng)素的體内發光(guāng)動力性?

D-熒光(guāng)素的給藥方式很多(duō)，常用的有腹腔注射、皮下(xià)注射和靜(jìng)脈注射，不同的給藥方式動力學曲線有差異，見(jiàn)下(xià)圖片。對于大部分研究，腹腔/皮下(xià)注射約10-20min後達到(dào)熒光(guāng)信号峰值，靜(jìng)脈注射約2-5min達到(dào)信号峰值。【圖片來自(zì)：Bollinger, Robert Albin. Evaluation of the Light Emission Kinetics in Luciferin/Luciferase-Based In Vivo Bioluminescence Imaging for Guidance in the Development of Small Animal Imaging Study Design.】

10. 動物(wù)對重複注射D-熒光(guāng)素的反應如何?

D-熒光(guāng)素不會(huì)影響動物(wù)（沒有明顯毒性或免疫反應）。

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