活體成像研究底物(wù)之：
Coelenterazine 腔腸素（Rluc/Gluc報(bào)告基因）
— —活體成像研究/體外生(shēng)物(wù)發光(guāng)研究
搜索關鍵詞：
Rluc 報(bào)告基因；Renilla Luciferase 海腎熒光(guāng)素酶；Coelenterazine 腔腸素；D-Luciferin Sodium D-螢火蟲熒光(guāng)素鈉鹽；In vivo imaging 活體成像研究；雙熒光(guāng)素酶報(bào)告基因檢測；CAS：55779-48-1；
基本描述：
腔腸素（Coelenterazine）是在水(shuǐ)生(shēng)生(shēng)物(wù)中發現的一(yī)種發光(guāng)基團（luminophore），是許多(duō)熒光(guāng)素酶的作用底物(wù)，包括海腎熒光(guāng)素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜錨定熒光(guāng)素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和薮枝蟲熒光(guāng)素酶（Obelia luciferase），和發光(guāng)蛋白(bái)包括水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)（Aequorin）的構成之一(yī)。前者的作用原理是以腔腸素為(wèi)底物(wù)的熒光(guāng)素酶，在含分子氧的條件(jiàn)下(xià)，氧化腔腸素産生(shēng)高(gāo)能(néng)量的中間産物(wù)，在此過程發射藍色光(guāng)，光(guāng)波長(cháng)在450~480nm。不同于甲蟲（或螢火蟲）熒光(guāng)素/熒光(guāng)素酶（FLuc）系統不同，在含分子氧的條件(jiàn)下(xià)，還(hái)需要ATP和Mg2+的存在才能(néng)同時發光(guāng)，光(guāng)波長(cháng)在550-570nm。由于生(shēng)物(wù)發光(guāng)信号和底物(wù)的差異，RLuc常常與FLuc聯合用于多(duō)報(bào)告基因研究。後者的作用原理是由脫輔基水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的複合物(wù)形成活化的水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)（Aequorin），一(yī)旦與鈣離子結合後，複合物(wù)結構被破壞，腔腸素被氧化生(shēng)成高(gāo)能(néng)産物(wù)（Coelenteramide），同時釋放(fàng)出CO2和藍色光(guāng)。
腔腸素應用甚是廣泛，包括：1）活細胞或組織的鈣離子檢測；2）細胞或組織的超氧化物(wù)和過氧亞硝基陰離子（活性氧，ROS）化學發光(guāng)檢測；3）基因報(bào)告基因檢測；4）動物(wù)活體檢測；5）ELISA和生(shēng)物(wù)發光(guāng)共振能(néng)量轉移（BRET）用于蛋白(bái)相(xiàng)互作用研究；6）藥物(wù)高(gāo)通(tōng)量篩選（HTS）；
腔腸素的幾個(gè)重要應用：
A、腔腸素/水(shuǐ)母蛋白(bái)複合物(wù)用于鈣離子檢測（Coelenterazine/aequorin complex for calcium measurement）
A1、與傳統熒光(guāng)法鈣離子濃度檢測的優勢
傳統熒光(guāng)法鈣離子檢測工(gōng)具琳琅滿目，由紫外光(guāng)激發到(dào)可見(jiàn)光(guāng)激發的鈣離子檢測，比如，Fura-2激發光(guāng)比率型熒光(guāng)探針，Fluo-8最亮的鈣離子熒光(guāng)探針，鈣離子檢測的靈敏度越來越高(gāo)，也越來越方便，對儀器(qì)的要求也越來越低(dī)，那麽腔腸素/水(shuǐ)母蛋白(bái)系統對鈣離子檢測的優勢在哪呢(ne)？
○ 鈣離子/水(shuǐ)母蛋白(bái)複合物(wù)（Ca2+/aequorin complex）能(néng)檢測寬廣範圍的鈣離子濃度，從(cóng)~0.1μM到(dào)＞100μM。
○ 比熒光(guāng)法探針的背景低(dī)，樣本本身不會(huì)發生(shēng)自(zì)熒光(guāng)。
○ 雖然信号比熒光(guāng)法低(dī)，但用成像儀能(néng)得到(dào)更高(gāo)的信噪比。
○ 水(shuǐ)母蛋白(bái)複合物(wù)（aequorin complex）不會(huì)從(cóng)細胞内洩露出來，因此能(néng)監測幾小(xiǎo)時至數天内細胞鈣離子（Ca2+）濃度變化。
A2、工(gōng)作原理
由脫輔基水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的複合物(wù)形成活化的水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)（Aequorin），一(yī)旦與鈣離子結合後，複合物(wù)結構被破壞，腔腸素被氧化生(shēng)成高(gāo)能(néng)産物(wù)（Coelenteramide），同時釋放(fàng)出CO2和藍色光(guāng)（~466nm）。
圖1. 腔腸素/水(shuǐ)母蛋白(bái)複合物(wù)用于鈣離子檢測的反應流程。
B、生(shēng)物(wù)共振能(néng)量轉移（BRET for assaying protein-protein interactions）
B1、工(gōng)作原理
BRET是一(yī)種高(gāo)級的、無破壞性和以細胞為(wèi)基礎的檢測技(jì)術(shù)，極其适合蛋白(bái)組學研究，包括受體研究和信号轉導途徑的路(lù)線圖。該技(jì)術(shù)是基于含生(shēng)物(wù)發光(guāng)熒光(guāng)素酶和GFP變體融合蛋白(bái)之間的非放(fàng)射性能(néng)量轉移。
大部分應用中融合供體是海腎熒光(guāng)素酶（RLuc），而不是水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)（Aequorin），目的是為(wèi)了避免對水(shuǐ)母來源GFP突變蛋白(bái)的内源性親和性。受體是黃色熒光(guāng)蛋白(bái)（YFP），能(néng)夠提高(gāo)良種發射光(guāng)間的光(guāng)譜區分。當供體和受體靠近，對腔腸素衍生(shēng)物(wù)底物(wù)催化降解後産生(shēng)的能(néng)量從(cóng)熒光(guāng)素酶轉移到(dào)YFP，從(cóng)而使其釋放(fàng)自(zì)身的熒光(guāng)。BRET比值的計算(suàn)顯示體内是否存在蛋白(bái)-蛋白(bái)相(xiàng)互作用，這種檢測方法有效去除光(guāng)輸出波動可能(néng)造成數據的變動，比如由于反應體積、細胞類型、每孔細胞數目和/孔間信号延誤等引起光(guāng)輸出波動。
B2、BRET與FRET相(xiàng)比的優勢
熒光(guāng)共振能(néng)量轉移（FRET），生(shēng)物(wù)發光(guāng)供體被第二種熒光(guāng)素所替代，其發射光(guāng)譜與受體熒光(guāng)素的激發光(guāng)譜重疊。與FRET相(xiàng)比，BRET的主要優勢在于：沒有光(guāng)淬滅或供體蛋白(bái)的光(guāng)異構化，對細胞無光(guāng)損傷，無光(guāng)散射，或細胞或酶标闆的自(zì)發熒光(guāng)。因沒有受體直接激發引起的光(guāng)發射，BRET背景更低(dī)，允許檢測更低(dī)濃度蛋白(bái)間的相(xiàng)互作用。
C、報(bào)告基因檢測（Rluc as a reporter gene）
海腎熒光(guāng)素酶（Rluc）用作報(bào)告基因以研究體内外的基因調控和功能(néng)，普遍用于多(duō)重轉錄報(bào)告基因檢測或用作熒光(guāng)蟲熒光(guāng)素酶轉染的内參。
工(gōng)作原理如下(xià)：海腎熒光(guāng)素酶（RLuc），分子量為(wèi)36kDa的單體蛋白(bái)，在氧氣的作用下(xià)氧化腔腸素生(shēng)成熒光(guāng)（見(jiàn)圖2）。Rluc不需要通(tōng)過後期的翻譯加工(gōng)來獲得活性，隻需要翻譯後就(jiù)能(néng)用作基因報(bào)告子。
圖2. 海腎熒光(guāng)素酶（Rluc）催腔腸素發光(guāng)的反應流程
我司（懋康生(shēng)物(wù)Maokangbio）提供天然腔腸素以及幾種腔腸素衍生(shēng)物(wù)，它們對鈣離子的親和力，光(guāng)譜特性，以及應用傾向上(shàng)會(huì)有差異，詳見(jiàn)表1—天然腔腸素及其衍生(shēng)物(wù)的光(guāng)譜特性，表2—天然腔腸素及其衍生(shēng)物(wù)的應用差異選擇适當的産品。
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表1 – 天然腔腸素及其衍生(shēng)物(wù)的光(guāng)譜特性 |
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貨号 |
Em (nm) |
RLC1 |
Relative Intensity2 |
Half-rise time (ms)3 |
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Coelenterazine native |
MX4606 |
466 |
1.00 |
1 |
6-30 |
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Coelenterazine h |
MX4607 |
466 |
0.75 |
16 |
6-30 |
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Coelenterazine 400 a |
MX4610 |
400 |
/ |
/ |
/ |
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Coelenterazine hcp |
MX4614 |
445 |
0.65 |
500 |
2-5 |
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Coelenterazine cp |
MX4613 |
442 |
0.63 |
28 |
2-5 |
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Coelenterazine f |
MX4612 |
472 |
0.80 |
20 |
6-30 |
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Coelenterazine n |
MX4615 |
468 |
0.25 |
0.15 |
6-30 |
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Coelenterazine e |
MX4611 |
0.5 |
4 |
0.15-0.3 |
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[1] RLC = relative luminescence capacity: Total time-integrated emission of aequorin in saturating Ca2+relative to native aequorin = 1.0. [2] Ratio of the luminescence of aequorin reconstituted with coelenterazine analog relative to native aequorin at 100 nM Ca2+. [3] Half-Rise Time: The half-rise time is the time for the luminescence signal to reach 50% of the maximum after addition of 1 mM Ca2+to a standard of aequorin reconstituted with the coelenterazine analog of interest. All data are from O. Shimomura in Cell Calcium 14, 373 (1993). |
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表2 – 天然腔腸素及其衍生(shēng)物(wù)的應用差異 |
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産品名稱 |
貨号 |
應用特征 |
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Coelenterazine native |
MX4606 |
應用非常廣泛的标準底物(wù)。腔腸素是天然水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)複合物(wù)的發光(guāng)基團，也是海腎熒光(guāng)素酶（Rluc）的底物(wù)。底物(wù)的快速再生(shēng)（fast regeneration）比較重要的實驗推薦使用天然腔腸素。 1）生(shēng)物(wù)發光(guāng)檢測鈣離子的靈敏度非常高(gāo)，檢測範圍從(cóng)0.1µM到(dào)＞100µM；2）使用腔腸素監測報(bào)告基因表達是其主要應用；3）其他應用包括生(shēng)物(wù)共振能(néng)量轉移BRET，化學發光(guāng)檢測細胞或組織内的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子水(shuǐ)平（ROS）； |
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Coelenterazine h |
MX4607 |
1）腔腸素h形成的水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)複合物(wù)比天然腔腸素複合物(wù)的光(guāng)強度高(gāo)10倍以上(shàng)；2）比天然腔腸素對鈣離子敏感度更高(gāo)；3）也适用報(bào)告基因分析。 |
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Coelenterazine 400 a |
MX4610 |
也稱為(wèi)DeepBlue C，是一(yī)種腔腸素衍生(shēng)物(wù)，用作海腎熒光(guāng)素酶Rluc的底物(wù)，發射峰約400nm。含GFP受體的BRET研究是Rluc的首選底物(wù)，因其對GFP受體的發射波幹擾非常小(xiǎo)。不可用作Gluc底物(wù)。 |
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Coelenterazine hcp |
MX4614 |
其生(shēng)物(wù)發光(guāng)強度最高(gāo)（腔腸素hcp形成水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)複合物(wù)的熒光(guāng)強度比天然腔腸素複合物(wù)高(gāo)190倍），對Ca2+反應速度快。 |
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Coelenterazine cp |
MX4613 |
Coelenterazine cp産生(shēng)水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)複合物(wù)的光(guāng)強度是天然腔腸素複合物(wù)的15倍，且具有更快的Ca2+反應性。 |
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Coelenterazine f |
MX4612 |
腔腸素f形成的水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)複合物(wù)的光(guāng)強度是天然腔腸素複合物(wù)的20倍，最大發射波長(cháng)約長(cháng)8nm。具有最好的細胞滲透性。當需要具極高(gāo)鈣離子Ca2+靈敏度的水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)複合物(wù)，建議用腔腸素f。 |
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Coelenterazine n |
MX4615 |
所有的腔腸素衍生(shēng)物(wù)中熒光(guāng)強度最弱，對Ca2+反應時間明顯慢(màn)于天然腔腸素。一(yī)種非常有用的低(dī)靈敏腔腸素。 |
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Coelenterazine e |
MX4611 |
體外水(shuǐ)母發光(guāng)蛋白(bái)再生(shēng)中腔腸素e的速度最高(gāo)，具有雙發射峰，分别為(wèi)405nm和465nm，使其能(néng)在pCa 5-7範圍内通(tōng)過雙發射峰熒光(guāng)強度比率的方式測定Ca2+濃度，提高(gāo)檢測準确度。但由于滲透性差，不适合胞内應用。在溶液中穩定性差。 |
腔腸素的訂購信息：
懋康生(shēng)物(wù)提供非常全面的腔腸素及其衍生(shēng)物(wù)産品，且有多(duō)重包裝形式供應，選擇性高(gāo)。進口品質，保質保量，部分現貨供應。歡迎來電(diàn)咨詢，電(diàn)話：021-54736159，QQ：2971634497，1563822900。
腔腸素系列産品重要事(shì)項：
1. 腔腸素凍幹粉需-20℃避光(guāng)保存，且保存在惰性氣體下(xià)。
2. 溶于甲醇或乙醇，不可溶于DMSO。
3. 腔腸素儲存液不建議保存在-20℃或-70℃。因腔腸素是一(yī)種高(gāo)能(néng)量的雙雜(zá)環丁酮環狀結構，即使在低(dī)溫下(xià)也會(huì)自(zì)發降解。
綜合以上(shàng)的特征，我司懋康生(shēng)物(wù)提供所有凍幹粉産品都含惰性氣體保證其穩定性。且多(duō)以小(xiǎo)包裝（50μg或500μg）的形式提供，以減少因單次使用不完造成的資源浪費(fèi)。
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貨号 |
名稱 |
規格 |
價格（元） |
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MX4606-500UG |
Coelenterazine Native天然腔腸素 |
500μg |
598 |
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MX4606-1MG |
Coelenterazine Native天然腔腸素 |
2×500μg |
1018 |
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MX4606-5MG |
Coelenterazine Native天然腔腸素 |
5mg |
2398 |
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MX4606-10MG |
Coelenterazine Native天然腔腸素 |
10mg |
3598 |
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MX4608-500UG |
Coelenterazine h腔腸素h |
500μg |
928 |
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MX4608-1MG |
Coelenterazine h腔腸素h |
2×500μg |
1468 |
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MX4610-500UG |
Coelenterazine 400 a腔腸素400a |
500μg |
828 |
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MX4610-1MG |
Coelenterazine 400 a腔腸素400a |
2×500μg |
1380 |
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MX4611-500UG |
e-Coelenterazine腔腸素e |
500μg |
928 |
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MX4611-1MG |
e-Coelenterazine腔腸素e |
2×500μg |
1468 |
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MX4612-500UG |
Coelenterazine f腔腸素f |
500μg |
928 |
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MX4613-250UG |
Coelenterazine cp腔腸素cp |
250μg |
1482 |
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MX4614-250UG |
Coelenterazine hcp腔腸素hcp |
250μg |
1482 |
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MX4615-50UG |
Coelenterazine n腔腸素n |
50μg |
1160 |
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MX4615-250UG |
Coelenterazine n腔腸素n |
250μg |
3384 |
體内注射用腔腸素産品：
我司（懋康生(shēng)物(wù)）特别提供專門(mén)用于體内動物(wù)實驗研究用的注射用腔腸素産品。粉末不僅純度非常高(gāo)，且提供特别溶劑以增強粉末的溶解能(néng)力。
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貨号 |
名稱 |
規格 |
價格（元） |
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MX4607-1MG |
Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔腸素 |
2×500μg |
1698 |
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MX4607-5MG |
Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔腸素 |
10×500μg |
5729 |
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MX4607-10MG |
Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔腸素 |
20×500μg |
10800 |
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MX4609-1MG |
Injectable h-Coelenterazine 注射用腔腸素h |
2×500μg |
1898 |
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MX4609-10MG |
Injectable h-Coelenterazine 注射用腔腸素h |
20×500μg |
10800 |
應用示例【生(shēng)物(wù)化學發光(guāng)體内成像】
Fig. In vivo visualization of mitochondrial Ca2+uptake in the hindlimb muscle after stimulation of the sciatic nerve. (A) Direct visualization of Ca2+-induced bioluminescence in the hindlimb muscle after tetanic stimulation of the sciatic nerve (5 ms pulses at 50 Hz for 2.5 s). Each frame represents 1 s of light accumulation superimposed with the video image taken before the acquisition of bioluminescence. The FOV was 16×12 cm. Smoothing has been applied to the bioluminescent image overlay to a resolution of 1 mm. Color scale is in photons/pixel/s. (B) Mice were injected (i.v) with native coelenterazine (4 mg/kg) and Ca2+-induced light emission was recorded immediately after in the hindlimb muscles in response to tetanic stimulations applied every 2 minutes over more than 1.5 hours. The plot shows the increasing amplitude of the light response (photons/s) as a function of time.【文獻來源：Non-Invasive In Vivo Imaging of Calcium Signaling in Mice. PMC1991622】
注意事(shì)項
1）所有産品僅供科研用途，不可用做臨床或診斷用途。
2）為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】
上海夢澤生物科技有限公司是一(yī)家涉足于生(shēng)命科學和生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域研究的試劑、儀器(qì)和實驗室消耗品與實驗服務工(gōng)作，主要從(cóng)事(shì)細胞生(shēng)物(wù)學、植物(wù)學、分子生(shēng)物(wù)學、免疫學、生(shēng)物(wù)化學、蛋白(bái)組學。生(shēng)物(wù)制藥與診斷試劑研發生(shēng)産等領域。 本公司秉承“以人為(wèi)本，以誠為(wèi)信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為(wèi)廣大客戶提供優質産品。
