D-Luciferin Firefly, Free Acid D-螢火蟲熒光(guāng)素（遊離酸）

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D-熒光(guāng)素（D-Luciferin）；Luc報(bào)告基因底物(wù)；螢火蟲熒光(guāng)素酶Firefly luciferase；D-熒光(guāng)素鉀鹽；D-熒光(guāng)素鈉鹽；生(shēng)物(wù)發光(guāng)成像技(jì)術(shù)（Bioluminescence imaging，BLI）；Luminometer熒光(guāng)計；CAS NO：2591-17-5；

基本描述：

D-熒光(guāng)素（D-Luciferin）是熒光(guāng)素酶（Luciferase）的常用底物(wù)，普遍用于整個(gè)生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域，特别是體内活體成像技(jì)術(shù)。作用機(jī)制是在ATP和熒光(guāng)素酶的作用下(xià)，D-熒光(guāng)素（底物(wù)）被氧化發光(guāng)。當熒光(guāng)素過量時，産生(shēng)的光(guāng)量子數與熒光(guāng)素酶的濃度呈正相(xiàng)關性（見(jiàn)下(xià)圖）。将攜帶熒光(guāng)素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染進入細胞後，導入研究動物(wù)如大小(xiǎo)鼠體内，之後注入熒光(guāng)素，通(tōng)過生(shēng)物(wù)發光(guāng)成像技(jì)術(shù)（BLI）來檢測光(guāng)強度變化，從(cóng)而實時監測疾病發展狀态或藥物(wù)的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生(shēng)物(wù)發光(guāng)強度的變化來指示能(néng)量或生(shēng)命體征。

D-熒光(guāng)素也常用于體外研究，包括熒光(guāng)素酶和ATP水(shuǐ)平分析；報(bào)告基因分析；高(gāo)通(tōng)量測序和各種污染檢測。目前市(shì)場上(shàng)有三種産品形式，D-熒光(guāng)素（遊離酸），D-熒光(guāng)素（鈉鹽），和D-熒光(guāng)素（鉀鹽）。這三種産品主要差别在于溶解特性。D-熒光(guāng)素（遊離酸）在水(shuǐ)以及緩沖體系内的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。但鈉鹽和鉀鹽形式的D-熒光(guāng)素能(néng)夠非常容易且快速的溶入水(shuǐ)或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特别适合體内實驗。配成溶液後的三種産品，在絕大多(duō)數應用上(shàng)都沒有實質性的差别。

基本特性：

1）  CAS NO：2591-17-5

2）  化學名：(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid; D-Luciferin Firefly, free acid D-螢火蟲熒光(guāng)素遊離酸，D-甲蟲熒光(guāng)素遊離酸；

3）  分子式：C11H8N2O3S2

4）  分子量：280.32 g/mol

5）  純度：＞99% (HPLC)

6）  外觀：類白(bái)色至淺黃色粉末

7）  溶解性：溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50mg/ml），溶于弱堿，微溶于水(shuǐ)

8）  化學結構圖：

保存與運輸方法

保存：-20℃幹燥避光(guāng)保存，有效期2年(nián)。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）螢火蟲熒光(guāng)素（firefly luciferin）和甲蟲熒光(guāng)素（beetle luciferin）皆相(xiàng)同化合物(wù)，即：(S)-2-(6-Hydroxy-2- benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylic acid，僅不同公司在命名上(shàng)的差異。

2）螢火蟲熒光(guāng)素（firefly luciferin）在保存和操作的過程中需要避光(guāng)。另，水(shuǐ)溶性儲存液經過濾除菌後，可置于-20℃或-80℃分裝凍存，避免反複凍融。若條件(jiàn)允許，對儲存液充氮氣或氩氣（防止氧化），穩定性和保存時間更長(cháng)，長(cháng)達1年(nián)。

3）螢火蟲熒光(guāng)素（firefly luciferin）的注射方式，以及動物(wù)類型、體重等都會(huì)影響熒光(guāng)信号發射，建議每次實驗都要做熒光(guāng)素酶動力學曲線，确定最佳信号平台期和最佳檢測時間。

4）紫外線和潮氣會(huì)産生(shēng)脫氫熒光(guāng)素，是一(yī)種熒光(guāng)素酶的競争性抑制劑。因此需小(xiǎo)心保存和處理D-熒光(guāng)素。最好-20℃避光(guāng)幹燥保存。

5）為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

A．體外生(shēng)物(wù)發光(guāng)檢測

1. 儲存液制備

【注意】：建議大量實驗前先取少量原料（D-熒光(guāng)素遊離酸）溶于你的緩沖液，以測試其溶解性。

【配置方法】：要溶解螢火蟲熒光(guāng)素遊離酸到(dào)生(shēng)理鹽中，首先用NaOH或KOH調整緩沖液到(dào)預測的摩爾堿度，然後加入D-熒光(guāng)素遊離酸（如15mg/ml），邊攪拌邊促進溶解。如果仍有沉澱，調整pH到(dào)更高(gāo)直至完全溶解。最後用酸調整pH到(dào)所需值。混勻後立即使用或分裝于-80℃避光(guāng)凍存，避免反複凍融。

2. 熒光(guāng)素酶反應緩沖液制備

2.1 配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250µM CoA，150µM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻資料來調整。按照(zhào)以上(shàng)配方制備熒光(guāng)素酶反應緩沖液（2×）。

3. 收集細胞裂解上(shàng)清（熒光(guāng)素酶表達）

根據需要檢測的細胞類型，選擇合适的裂解液進行細胞裂解，離心收集上(shàng)清後續檢測待用。

4. 螢火蟲熒光(guāng)信号檢測

【注①】：螢火蟲熒光(guāng)信号的檢測方法大體上(shàng)取決于冷光(guāng)測定儀（luminometer）類型（是手動型熒光(guāng)計、單管注射型或者酶标闆讀(dú)數型熒光(guāng)計）。根據特定發光(guāng)測定儀，來考慮注射用量和程序設置。

【注②】：需設置不含熒光(guāng)素酶的孔（用作陰性對照(zhào)），以測定背景熒光(guāng)。

例：注射式冷光(guāng)測定儀（injectible luminometer，單樣或微孔闆，200µl終體積）

a）吸取100µl熒光(guāng)素酶反應緩沖液（2×）到(dào)一(yī)幹淨的冷光(guāng)測定儀比色皿或96孔闆的各孔（最好使用全白(bái)平底的96孔闆）；

b）吸取50~98µl裂解上(shàng)清到(dào)皿或孔内；

c）如果有需要，用水(shuǐ)來補足使得總體積到(dào)198µl；

d）設置程序注射2µl熒光(guāng)素儲存液（使工(gōng)作濃度150µg/ml），程序：2~5秒(miǎo)延遲（delay），之後10s測定。

B．活體成像分析

1）工(gōng)作液準備：準備少量的PBS（w/o Mg2+）, pH=12以及PBS（w/o Mg2+）, pH=2緩沖液。先取10mg D-熒光(guāng)素遊離酸到(dào)165ml PBS（w/o Mg2+）, pH=12，充分溶解後，再加入165ml PBS（w/o Mg2+）, pH=2中和溶液，混勻得到(dào)30mg/ml的工(gōng)作液。0.2µm濾膜過濾除菌。混勻後立即使用或分裝于-80℃避光(guāng)凍存，避免反複凍融。一(yī)旦使用，放(fàng)到(dào)4℃解凍，保持冰冷且避光(guāng)。

2）注射方式：适用于靜(jìng)脈注射，腹腔注射，肌肉注射和鼻内注射等，根據具體方式調整注射體積，最常用的注射濃度為(wèi)150mg/kg體重。

3）檢測方式：注射入體内10-20 min（待光(guāng)信号達到(dào)最強穩定平台期），再進行成像分析。

【注意】：建議對每隻動物(wù)模型都需要建立熒光(guāng)素酶動力學曲線，從(cóng)而确定最高(gāo)信号檢測時間和信号平台期。

産品訂購：更大包裝或産品技(jì)術(shù)問題，請來電(diàn)/在線咨詢，電(diàn)話：021-54736159 。網站：www.maokangbio.com。

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注意事(shì)項

為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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