Zeocin (100mg/ml)  博萊黴素（100 mg/ml）

【溫馨提示】：如果你對市(shì)場上(shàng)常見(jiàn)中文名都叫【博萊黴素】，但英文名又(yòu)不同的一(yī)些産品感到(dào)有所迷惑，可參考我司【懋康生(shēng)物(wù)】整理的Bleomycins (BLMs) 博萊黴素家族常用抗生(shēng)素成員(yuán)的應用選擇，也許有所收獲。

博萊黴素家族常見(jiàn)産品：

篩選抗生(shēng)素：Zeocin【凍幹粉】  Zeocin【100mg/ml】     Phleomycin 腐草(cǎo)黴素

細胞功能(néng)研究：Bleomycin Sulfate 硫酸博萊黴素     Bleomycin A5 Hydrochloride 鹽酸博萊黴素A5

産品标簽

Zeocin 博萊黴素（博來黴素）；Phleomycin 腐草(cǎo)黴素；Sh ble基因；Streptomyces verticillus 輪枝鏈黴菌；Hygromycin B 潮黴素B；G418遺傳黴素；CAS NO.：11006-33-0

産品信息

【提示1】：另現貨供應Invitrogen原裝進口的Zeocin（博來黴素）；

【提示2】：對Zeocin不敏感的細胞，如絲狀真菌和一(yī)些酵母菌，建議使用腐草(cǎo)黴素（貨号：MS0008-1ML），抗性基因同樣為(wèi)Sh ble。

【提示3】：特價供應含Zeo+基因序列的質粒— — pcDNA 3.1/Zeo（+）（Invitrogen of Thermo），序列圖譜點擊下(xià)載文檔。

産品描述

Zeocin™是博來黴素/腐草(cǎo)黴素（bleomycin/phleomycin）抗生(shēng)素家族的成員(yuán)之一(yī)，從(cóng)輪枝鏈黴菌Streptomyces verticillus中分離得到(dào)。作用譜廣泛，對細菌、真菌（包括酵母菌）、植物(wù)和哺乳動物(wù)細胞具很強的毒性。

Zeocin™是腐草(cǎo)黴素D1的商業(yè)名稱，一(yī)種堿性、水(shuǐ)溶性、銅離子螯合的糖肽抗生(shēng)素。銅離子的存在使得溶液為(wèi)藍色，此銅螯合的形式為(wèi)無活性。當抗生(shēng)素進入細胞後，二價銅離子（Cu2+）被還(hái)原為(wèi)一(yī)價銅離子（Cu+），并被細胞内的巯基化合物(wù)去除。銅離子被去除後，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，最終導緻細胞死亡。來自(zì)Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因賦予Zeocin抗性，該基因編碼一(yī)種13,665Da大小(xiǎo)的蛋白(bái)，以化學計量方式結合Zeocin，抑制其DNA雙鏈切割活性。因此，能(néng)表達此蛋白(bái)的真核和原核宿主細胞被賦予Zeocin抗性。

本品為(wèi)溶于去離子水(shuǐ)的無菌溶液，濃度為(wèi)100mg/ml，細胞培養級别。

産品特性

1）CAS NO.：11006-33-0

2）化學式：C55H83N19O21S2Cu

3）分子量：1137.41 g/mol

4）外觀：藍色溶液（100mg/ml in deionized，autoclaved water）

保存與運輸方法

保存：-20℃避光(guāng)保存，至少1年(nián)有效，避免反複凍融。

運輸：冰袋運輸。

建議工(gōng)作濃度

1）大腸杆菌篩選：25-50μg/mL（低(dī)鹽LB培養基，NaCl濃度不能(néng)超過5g/L）

2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養基）

3）哺乳動物(wù)細胞篩選：50-1000μg/mL（合适培養基，根據細胞系而不同）

注意事(shì)項

1）Zeocin™對光(guāng)敏感，需将抗生(shēng)素，或含該抗生(shēng)素的平闆或培養基置于黑(hēi)暗(àn)處。

2）降低(dī)細菌培養基的鹽濃度，調整pH到(dào)7.5使其保持活性，因高(gāo)離子強度和酸或堿性都會(huì)抑制Zeocin™活性。

3）儲存Zeocin™在-30°C~-10°C，使用前需冰上(shàng)融化。

4）Zeocin™有毒，操作時需注意防護，切勿與身體或皮膚直接接觸。

5）Zeocin™是Invivogen公司的商标産品。

6）為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

操作步驟（以哺乳動物(wù)細胞為(wèi)例）

【注1】：Zeocin™的殺滅機(jī)制不同于新生(shēng)黴素（neomycin）和潮黴素B（hygromycin B），細胞不會(huì)聚集成團和從(cóng)培養闆表面脫落。一(yī)旦接觸到(dào)Zeocin™，敏感細胞會(huì)出現如下(xià)的形态變化：1）細胞體積明顯增加（類似于巨細胞病毒感染容納性細胞引起的腫大效應）；2）異常的細胞形狀包括細胞長(cháng)臂（long appendages）出現；3）胞漿内出現大型空泡（源于内質網、高(gāo)爾基體或支撐蛋白(bái)的破裂）；4）質膜和核膜破裂，導緻膜上(shàng)出現許多(duō)孔。這些敏感細胞最終會(huì)完全破損，僅僅以細胞碎片的形式存在。

【注2】：Zeocin™抗性細胞按正常周期分化産生(shēng)不同于敏感細胞的克隆。抗性細胞在形态上(shàng)，與未接觸Zeocin™的正常細胞沒有任何差異。

【注3】：Zeocin™用于哺乳動物(wù)細胞篩選常用濃度為(wèi)50-1000µg/ml（平均常用濃度為(wèi)250-400μg/mL），影響篩選濃度的主要因素包括離子強度，細胞類型，細胞密度以及生(shēng)長(cháng)速率。以下(xià)步驟僅作參考，請根據自(zì)身實驗體系做适當調整。

一(yī)、細胞對Zeocin™敏感性的确定（殺滅曲線建立）

1）重新鋪闆或者将滿盤細胞重新分盤，使得細胞密度約25%，按照(zhào)8個(gè)平闆/組準備，培養24h，去除舊(jiù)培養基。

2）加入含不同濃度Zeocin™的篩選培養基，Zeocin™濃度可設置為(wèi)0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個(gè)濃度做3個(gè)平行；也可根據自(zì)身實驗體系，設置不同的濃度梯度。

3）每3-4天更換新鮮的篩選培養基，并觀察存活細胞的比例。選擇在合适時間（1-2周内）殺死大多(duō)數細胞的濃度為(wèi)最佳工(gōng)作濃度。【注】：若是難以在顯微觀察下(xià)區分活細胞，建議使用台盼藍染色來計算(suàn)存活細胞的數量，以确定Zeocin™的最适濃度。

二、篩選穩定轉染細胞系

1）轉染細胞，用100mm培養皿進行培養。以未轉染的細胞作為(wèi)陰性對照(zhào)。

2）轉染後，用預熱的1X PBS洗滌一(yī)次，加入新鮮培養基。

3）轉染48-72h後，用含有最佳濃度Zeocin™（由滅殺曲線确定）的新鮮培養基篩選細胞。為(wèi)了更好的鑒定和篩選細胞集落，建議将細胞按比例稀釋成一(yī)系列濃度。

【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，按照(zhào)以下(xià)方法克服此類耐性：用含Zeocin™培養基進行細胞分盤，置于37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然後将細胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為(wèi)培養基的緩沖體系。重新将細胞置于37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間内終止細胞分化，使得Zeocin™能(néng)發揮作用，殺死細胞。

4）每3-4天更換新鮮的選擇培養基，直到(dào)出現細胞集落。

5）挑選并轉移克隆到(dào)96或48孔闆中。在進行更大孔徑培養闆或培養皿上(shàng)擴大培養之前，确保培養細胞密度近100%。

三、穩定轉染細胞系的維持培養

可采取以下(xià)方式維持培養穩定轉染細胞：

1）使用含相(xiàng)同劑量Zeocin™的篩選培養基來維持培養；

2）降低(dī)Zeocin™劑量為(wèi)原來的一(yī)半進行維持培養；

3）使用正好能(néng)預防敏感細胞生(shēng)長(cháng)但不足以緻死的Zeocin劑量來維持培養【根據殺滅曲線來判斷】；

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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