X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環己胺鹽（X-beta-D- glucuronide CHA salt）

——轉基因植物(wù)最常用報(bào)告基因GUS顯色底物(wù)，GUS染色定性研究

搜索關鍵詞：β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）,藍色顯色底物(wù),轉基因植物(wù)GUS表達, GUS染色（定性）,報(bào)告基因gusA（uidA）,活性檢測, CAS：114162-64-0

作用機(jī)制：

X-Gluc，也稱為(wèi)5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸），是β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）的顯色底物(wù)，由一(yī)種廣泛使用的報(bào)告基因gusA（uidA）所編碼。GUS水(shuǐ)解X-Gluc，生(shēng)成一(yī)種無色的葡萄糖醛酸和一(yī)種肉眼可見(jiàn)的氯-溴靛藍（chloro-bromoindigo）深藍色沉澱。利用這一(yī)特性，X-Gluc常用來檢測植物(wù)細胞和組織中的GUS表達；另外，X-Gluc還(hái)能(néng)用來檢測大腸杆菌引起的感染狀況；或檢測食物(wù)或水(shuǐ)源是否受細菌污染。

主要應用：轉基因植物(wù)報(bào)告基因GUS活性檢測，X-gluc用作顯色底物(wù)。

普遍應用優勢在于：絕大多(duō)數植物(wù)細胞内不存在内源性的GUS活性，而且GUS基因表達産物(wù)具有檢測方法簡單、靈敏度高(gāo)，易于定量及定性分析，能(néng)夠與其他蛋白(bái)質基因融合等優勢，因此，GUS基因為(wèi)植物(wù)工(gōng)程研究中應用最廣泛的報(bào)告基因（報(bào)道基因）之一(yī)。

1. GUS活性檢測（組織化學定位法，定性研究）

GUS催化底物(wù)X-gluc在酶活性位點生(shēng)成深藍色沉澱，為(wèi)研究外源基因在植物(wù)中表達具體部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和顯色産物(wù)非常穩定，植物(wù)中可以積累。

1.1 GUS染色液制備【作為(wèi)參考，可按照(zhào)具體實驗條件(jiàn)來調整】

1.2 GUS定性染色步驟

a）于預冷固定液（4%多(duō)聚甲醛溶液，新鮮制備）固定樣本30min，偶爾搖晃或置于低(dī)速搖床上(shàng)固定；

b）使用預冷的1×磷酸鹽或檸檬酸鹽酸溶液清洗固定樣本30-60min，中間更換幾次清洗液；

c） 真空滲透法将X-Gluc染色液加入待染色樣本【對于組織培養的拟南(nán)芥不需用真空滲透；】黑(hēi)暗(àn)條件(jiàn)室溫或者37°C孵育幾小(xiǎo)時或過夜，或者明顯的藍色沉澱出現（不超過24h）；

d）去離子清洗染色樣本；

e） 對于綠色樣本，使用70%乙醇脫色直到(dào)葉綠體完全去除，然後轉移到(dào)去離子水(shuǐ)内清洗；對于種子或其他樣本，參考文獻An Improved Clearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法；

f） 肉眼或顯微鏡下(xià)觀察，白(bái)色背景上(shàng)的藍色小(xiǎo)點即為(wèi)GUS表達位點。

【備注】：可直接訂購我司（MKbio）提供的GUS染色試劑盒（組織化學法） ，經濟實惠，使用方便，節省溶液配制的大量麻煩步驟。

2.  GUS活性檢測（熒光(guāng)分析法，定量研究）

GUS催化熒光(guāng)底物(wù)MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸，将其水(shuǐ)解為(wèi)4-MU（4-甲基傘型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解離後在365nm的光(guāng)激發下(xià)産生(shēng)455nm的熒光(guāng)。此時用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計測定得到(dào)的是相(xiàng)對值，因此同時需要用标準物(wù)4-MU進行校準。

熒光(guāng)定量分析GUS活性有兩種基本方法：1）在一(yī)個(gè)時間點測定GUS酶作用産物(wù)的總熒光(guāng)量，需要設定空白(bái)對照(zhào)，以消除内源熒光(guāng)強度；2）測定一(yī)段時間内GUS的動力學過程。在酶反應初始階段，酶作用産物(wù)與時間呈線性關系，而内源性熒光(guāng)物(wù)質的熒光(guāng)量與時間無線性關系。由此可計算(suàn)GUS酶活力。GUS酶活性通(tōng)常以μg MU/min/mg蛋白(bái)質。有時也可以用樣本的鮮重來表示。

2.1  檢測步驟【僅作參考，根據具體實驗條件(jiàn)做适當調整】

a）取約100mg愈傷組織或一(yī)片新鮮葉盤于1.5ml離心管内，加入100μl萃取緩沖液（extraction buffer）内勻漿。可加入少量沙子或玻璃珠提高(gāo)研磨效率。

萃取緩沖液（extraction buffer）配方：50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），10mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1%十二烷基肌氨酸，0.1% Triton X-100

b）4°C，15,000rpm離心5min。收集上(shàng)清轉移到(dào)另一(yī)幹淨的1.5ml離心管，冰上(shàng)放(fàng)置待用。

c） 取50μl上(shàng)述萃取上(shàng)清到(dào)0.5ml 37°C預熱的反應緩沖液（Assay buffer）；用移液槍吹勻或漩渦混勻。

反應緩沖液（Assay Buffer）：稱取17.6mg MUG溶于50ml萃取緩沖液，此時即為(wèi)1mM MUG反應液。4°C保存，2周穩定。

d）在某一(yī)時間段内（高(gāo)GUS活性樣本30min；或低(dī)GUS活性1h-過夜；）吸取100μl溶液到(dào)含900μl終止液（Stop Buffer）的1.5ml離心管内，做好标記。有可能(néng)采集3-4個(gè)時間點和過夜孵育的時間點熒光(guāng)量。【用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計在激發波長(cháng)365nm、發射波長(cháng)455nm下(xià)，狹縫10nm時測定不同時間點的熒光(guāng)強度值。】

e）以熒光(guāng)強度值對反應時間作曲線，求出單位時間的熒光(guāng)強度變化。用單位時間的熒光(guāng)強度變化除以參加反應的蛋白(bái)量，求出單位質量的蛋白(bái)單位時間的熒光(guāng)強度變化。

基本特性：

1）CAS NO：114162-64-0

2）英文同義名：5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid, cyclohexylammonium salt;X-beta-D- glucuronide CHA salt;X-Gluc CHA Salt; X-glu CHA Salt; X-glcA CHA Salt; BCIG CHA Salt;

3）分子式：C14H13BrClNO7 • C6H13N

4）分子量：521.79g/mol

5）純度：＞99%（HPLC）

6）外觀：白(bái)色至類白(bái)色結晶性粉末

7）溶解性：DMF、甲醇

8）化學結構式：

産品訂購：更大包裝或産品技(jì)術(shù)問題，請來電(diàn)/在線咨詢，電(diàn)話：021-54736159 。網站：www.maokangbio.com。

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【提示】可直接訂購我司代理的Markergene GUS reporter gene activity kit，原裝正品，歡迎咨詢。

注意事(shì)項

為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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