MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸/GUS熒光(guāng)底物(wù)

——轉基因植物(wù)最常用報(bào)告基因GUS熒光(guāng)顯色底物(wù)，GUS活性定量分析

搜索關鍵詞：β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）,藍色熒光(guāng)底物(wù),轉基因植物(wù)GUS表達, GUS活性（定量）,報(bào)告基因gusA（uidA）, X-Gluc,CAS：6160-80-1或881005-91-0

作用機(jī)制：

MUG，英文全名4-Methylumbelliferyl beta-D-glucuronide，中文全名4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸，CAS：6160-80-1或881005-91-0，一(yī)種最常用的β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）的熒光(guāng)顯色底物(wù)。GUS可水(shuǐ)解MUG生(shēng)成4-MU（4-甲基傘型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解離後在紫外光(guāng)的激發下(xià)能(néng)産生(shēng)藍色熒光(guāng)（Ex= 365nm，Em= 445nm）。GUS由大腸杆菌來源的報(bào)告基因gusA（uidA）所編碼，經常用來檢測飲用水(shuǐ)是否受大腸杆菌污染，以及用來對血液培養制品快速鑒定細菌污染情況。MUG作為(wèi)熒光(guāng)底物(wù)非常适合用在植物(wù)分子遺傳學研究來檢測各種啓動子驅動下(xià)的GUS基因表達量。MUG不僅能(néng)很好的測定植物(wù)裂解液和葉盤的GUS表達活性，且适用于全植物(wù)表達活性分析。

主要應用：

1. 轉基因植物(wù)報(bào)告基因GUS活性檢測，MUG用作熒光(guāng)顯色底物(wù)。

普遍應用優勢在于：絕大多(duō)數植物(wù)細胞内不存在内源性的GUS活性，而且GUS基因表達産物(wù)具有檢測方法簡單、靈敏度高(gāo)，易于定量及定性分析，能(néng)夠與其他蛋白(bái)質基因融合等優勢，因此，GUS基因為(wèi)植物(wù)工(gōng)程研究中應用最廣泛的報(bào)告基因（報(bào)道基因）之一(yī)。

GUS活性檢測（熒光(guāng)分析法，定量研究）

GUS催化熒光(guāng)底物(wù)MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸，将其水(shuǐ)解為(wèi)4-MU（4-甲基傘型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解離後在365nm的光(guāng)激發下(xià)産生(shēng)455nm的熒光(guāng)。此時用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計測定得到(dào)的是相(xiàng)對值，因此同時需要用标準物(wù)4-MU進行校準。

熒光(guāng)定量分析GUS活性有兩種基本方法：1）在一(yī)個(gè)時間點測定GUS酶作用産物(wù)的總熒光(guāng)量，需要設定空白(bái)對照(zhào)，以消除内源熒光(guāng)強度；2）測定一(yī)段時間内GUS的動力學過程。在酶反應初始階段，酶作用産物(wù)與時間呈線性關系，而内源性熒光(guāng)物(wù)質的熒光(guāng)量與時間無線性關系。由此可計算(suàn)GUS酶活力。GUS酶活性通(tōng)常以μg MU/min/mg蛋白(bái)質。有時也可以用樣本的鮮重來表示。

1.1 檢測步驟【僅作參考，根據具體實驗條件(jiàn)做适當調整】

a）取約100mg愈傷組織或一(yī)片新鮮葉盤于1.5ml離心管内，加入100μl萃取緩沖液（extraction buffer）内勻漿。可加入少量沙子或玻璃珠提高(gāo)研磨效率。

萃取緩沖液（extraction buffer）配方：50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），10mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1%十二烷基肌氨酸，0.1% Triton X-100

b）4°C，15,000rpm離心5min。收集上(shàng)清轉移到(dào)另一(yī)幹淨的1.5ml離心管，冰上(shàng)放(fàng)置待用。

c） 取50μl上(shàng)述萃取上(shàng)清到(dào)0.5ml 37°C預熱的反應緩沖液（Assay buffer）；用移液槍吹勻或漩渦混勻。

反應緩沖液（Assay Buffer）：稱取17.6mg MUG溶于50ml萃取緩沖液，此時即為(wèi)1mM MUG反應液。4°C保存，2周穩定。

d）在某一(yī)時間段内（高(gāo)GUS活性樣本30min；或低(dī)GUS活性1h-過夜；）吸取100μl溶液到(dào)含900μl終止液（Stop Buffer）的1.5ml離心管内，做好标記。有可能(néng)采集3-4個(gè)時間點和過夜孵育的時間點熒光(guāng)量。【用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計在激發波長(cháng)365nm、發射波長(cháng)455nm下(xià)，狹縫10nm時測定不同時間點的熒光(guāng)強度值。】

終止緩沖液（Stop Buffer）：溶解21.2g無水(shuǐ)碳酸鈉到(dào)800ml去離子水(shuǐ)，充分溶解，定容至1L，此時即為(wèi)0.2M Na2CO3溶液。

e）以熒光(guāng)強度值對反應時間作曲線，求出單位時間的熒光(guāng)強度變化。用單位時間的熒光(guāng)強度變化除以參加反應的蛋白(bái)量，求出單位質量的蛋白(bái)單位時間的熒光(guāng)強度變化。

2. 鑒定和分離大腸杆菌污染

本MUG瓊脂培養基用來食物(wù)或藥品内大腸杆菌的鑒定和分離。

2.1 按照(zhào)以下(xià)步驟配制培養基，

2.2 121℃高(gāo)壓滅菌15min；

2.3 冷卻至50℃，搖勻後倒入平闆，無菌超淨台内使其冷卻。

2.4 結果分析：鏡檢發現淺藍色熒光(guāng)，表明樣本受大腸杆菌（E. Coli）污染。樣本塗布到(dào)平闆上(shàng)培養24h，鏡檢若是沒有發現熒光(guāng)，需繼續培養24h，再次檢測熒光(guāng)以确認污染情況。

基本特性：

1）CAS NO：46160-80-1

2）同義名：4-Methylumbelliferylβ-D-glucuronide4-甲基傘型酮-β-D-葡糖苷酸；4-MUG；

3）分子式：C16H16O9

4）  分子量：352.29 g/mol（anhydrous）

5）  純度：≥98%（HPLC）

6）  外觀：白(bái)色或近白(bái)色粉末

7）  溶解性：溶于水(shuǐ)（0.35mg/ml），溶于0.1M Sorensen’s buffer（0.1 mM）

8）  化學結構：

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注意事(shì)項

為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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