Probes for reactive oxygen species（活性氧ROS探針）技(jì)術(shù)專題
Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光(guāng)素
Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基熒光(guāng)素
專題關鍵詞：
Aminophenyl fluorescein (APF)；Hydroxyphenyl fluorescein (HPF)；Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物(wù)質；DCFH-DA；CAS：359010-69-8；
基本描述：
氨基苯基熒光(guāng)素（APF）和羟苯基熒光(guāng)素（HPF）是由T. Nagano開(kāi)發的兩種活性氧（Reactive oxygen species, ROS）指示劑，比H2DCFDA（DCFH-DA, DCFH）具更優秀的特異性和穩定性。APF和HPF顯示有限的非選擇性反應，和相(xiàng)對較高(gāo)的光(guāng)誘導氧化抗性。APF和HPF具細胞膜滲透性，本身無熒光(guāng)，直到(dào)與羟基自(zì)由基或過氧亞硝基陰離子反應，還(hái)能(néng)與次氯酸陰離子反應，産生(shēng)強綠色熒光(guāng)（Ex/Em，~490/515nm），可用熒光(guāng)顯微鏡、高(gāo)通(tōng)量成像儀、熒光(guāng)酶标闆或流式細胞儀檢測。
工(gōng)作原理：
中性溶液中氨基苯基熒光(guāng)素（APF）和羟苯基熒光(guāng)素（HPF）幾乎是無熒光(guāng)，當與高(gāo)活性氧物(wù)質（highly reactive oxygen species, hROS）反應，能(néng)夠生(shēng)成具有高(gāo)熒光(guāng)強度的熒光(guāng)素（Ex/Em, 490/515nm），且能(néng)觀察到(dào)熒光(guāng)強度的增加【見(jiàn)下(xià)反應原理圖】。
探針特征：
□ APF，HPF選擇性檢測hROS比如羟基自(zì)由基（HO•）和過氧亞硝基陰離子（ONOO–），但不會(huì)與其他活性氧物(wù)質反應（•O2–,1O2, H2O2, NO等）；
□ 通(tōng)過加入辣根過氧化物(wù)酶（HRP）能(néng)定量測定過氧化氫H2O2;
□ 結合使用HPF和APF能(néng)特異性檢測次氯酸（OCl-）;
□ HPF和APF本身根本不會(huì)自(zì)氧化，從(cóng)而與其他試劑相(xiàng)比能(néng)得到(dào)更可靠的數據；
□ 能(néng)對活細胞進行成像檢測；
ROS探針檢測特異性比較：
□ 試劑配制：1mg HPF/APF分别溶于DMF配制成5mM儲存液。使用前用磷酸鹽溶液（0.1M, pH 7.4）稀釋500~5000倍（10～1μM）。将稀釋液加入樣本并孵育，然後測定熒光(guāng)值（Ex/Em, 490/515nm）。
□ 磷酸鹽緩沖液體系（0.1M, pH 7.4），每一(yī)種熒光(guāng)試劑（終濃度：10μM，0.1% DMF用作共溶劑）與各種活性氧物(wù)質反應。
□ HPF（Ex/Em=490/515nm）, APF（Ex/Em=490/515nm）, DCFH（Ex/Em=500/520nm）的熒光(guāng)強度測定。
表1. 活性氧探針（HPF, APF, DCFH）對各種活性氧物(wù)質的反應特異性
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ROS |
ROS産生(shēng)方法 |
HPF (MX4805) |
APF (MX4804) |
DCFH (MX4802) |
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HO• |
100 µM高(gāo)氯酸亞鐵(II)+1 mMH2O2 |
730 |
1200 |
7400 |
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ONOO– |
3 µM (終濃度) ONOO– |
120 |
560 |
6600 |
|
OCl- |
3 µM (終濃度) OCl- |
6 |
3600 |
86 |
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1O2 |
100 µM 3-(1,4-dihydro-1,4-epidioxy-1-naphthyl)propionic acid |
5 |
9 |
26 |
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•O2– |
100 µM KO2 |
8 |
6 |
67 |
|
H2O2 |
100 µM of H2O2 |
2 |
＜1 |
190 |
|
NO |
100 µM NOC-7 |
6 |
＜1 |
150 |
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ROO• |
100 µM AAPH |
17 |
2 |
710 |
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Autoxidation |
熒光(guāng)光(guāng)照(zhào)2.5h |
＜1 |
＜1 |
2000 |
ROS探針應用示例：
示例1：細胞經光(guāng)誘導的自(zì)氧化檢測（Light-induced autoxidation in cells）
1.1 探針加量：37℃避光(guāng)孵育細胞30min，HPF或DCFH-DA（10μM each）
1.2 熒光(guāng)測定：共聚焦顯微鏡觀察熒光(guāng)（激發波長(cháng)488nm，檢測波長(cháng)＞515nm）；488nm波長(cháng)輻射刺激細胞10s，然後再測定熒光(guāng)。
1.3 實驗圖片：
示例2：豬中性粒細胞的體内成像（Bioimaging of porcine neutrophils）
2.1 豬中性粒細胞的純化
a）從(cóng)豬血中純化中性粒細胞；b）将純化的中性粒細胞溶于KRPD緩沖液（Krebs-Ringer phosphate buffer）(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4)，置于冰上(shàng)直至使用。将其轉移到(dào)培養皿内。
2.2 探針加載與PMA刺激
a）加10μM HPF或APF到(dào)細胞，室溫孵育30min。b）加入佛波酯PMA（2ng/ml）刺激中性粒細胞；
2.3 中性粒細胞的體内成像
刺激前或刺激後10min用共聚焦顯微鏡觀察中性粒細胞（激發波長(cháng)488nm，觀察波長(cháng)505nm-550nm）。
圖. 中性粒細胞次氯酸陰離子（OCl-）檢測。同時加載兩個(gè)樣品，一(yī)個(gè)用HPF檢測，另一(yī)個(gè)用APF檢測。OCl-的生(shēng)成通(tōng)過APF檢測能(néng)看(kàn)到(dào)熒光(guāng)增強，通(tōng)過HPF檢測幾乎看(kàn)不到(dào)熒光(guāng)變化。
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貨号 |
名稱 |
規格 |
價格（元） |
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1mg |
2180 |
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1mg |
2180 |
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50mg |
546 |
【溫馨提示】：見(jiàn)我司（懋康生(shēng)物(wù)）整理的Probes for reactive oxygen species（活性氧探針）産品專題。
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貨号 |
名稱 |
規格 |
價格（元） |
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100~500T |
見(jiàn)站點 |
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100μl |
見(jiàn)站點 |
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MS5603-50ML |
tert-Butyl hydroperoxide solution (TBHP) 叔丁基過氧化氫溶液 |
50ml |
見(jiàn)站點 |
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MP5429-10MG |
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸 |
10mg |
見(jiàn)站點 |
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50 µg |
見(jiàn)站點 |
注意事(shì)項
為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】
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