H2DCFDA (DCFH-DA) 活性氧（ROS）熒光(guāng)探針

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産品關鍵詞

H2DCFDA (DCFH-DA); 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate 2',7'-二氯二氫熒光(guāng)素二乙酸酯；氧化應激探針；活性氧 ROS；過氧亞硝基陰離子（ONOO-）；CellROX Green Reagent；

産品信息

【溫馨提示】：對于使用量較少且要求更簡單方便，可選擇我司提供的活性氧檢測試劑盒（ROS assay kit）（#MX4801-1KIT），此試劑盒不僅含熒光(guāng)探針H2DCFDA，還(hái)包括陽性對照(zhào)。

産品描述

H2DCFDA(DCFH-DA)，英文全名2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，中文全名2',7'-二氯二氫熒光(guāng)素二乙酸酯，是一(yī)種通(tōng)用的氧化應激指示劑。具細胞膜滲透性，本身無熒光(guāng)。一(yī)旦進入細胞後，被細胞酯酶水(shuǐ)解生(shēng)成2',7'-二氯二氫熒光(guāng)素（2',7'-Dichlorodihydrofluorescein, DCFH），之後被快速氧化生(shēng)成強熒光(guāng)産物(wù)2',7'-二氯熒光(guāng)素（2',7'-dichlorofluorescein, DCF），可用熒光(guāng)光(guāng)譜檢測（Ex/Em= 504/529nm）。适用于檢測活性氧（ROS）和一(yī)氧化氮（•NO），以及确定總的氧化應激水(shuǐ)平。普遍用來監測細胞氧化還(hái)原過程。

本品以粉末形式提供，可直接溶于無水(shuǐ)DMSO配制成1-10mM儲存液，常用工(gōng)作濃度1-10μM，需根據自(zì)身的實驗體系或參考文獻進行優化。

産品特性

1）   CAS NO：4091-99-0

2）   化學名：Benzoic acid, 2-[3,6-bis(acetyloxy)-2,7-dichloro-9H-xanthen-9-yl]; 2-(2,7-dichloro-3,6-diacetyloxy -9H-xanthen-9-yl)-benzoic acid;

3）   英文同義名：DCFH-DA;2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate; 2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate; 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate;

4）   中文同義名：2',7'-二氯二氫熒光(guāng)素二乙酸酯；2,7-二氯二氫熒光(guāng)素二乙酸酯；

5）   分子式：C24H16Cl2O7

6）   分子量：487.29

7）   純度：≥97%

8）   外觀：白(bái)色至帶黃色光(guāng)澤的白(bái)色粉末

9）   溶解性：溶于DMSO（25mg/ml）、DMF（25mg/ml）、無水(shuǐ)乙醇（25mg/ml）

10）化學結構：

保存與運輸方法

保存：-20ºC避光(guāng)幹燥保存，至少2年(nián)有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）   有機(jī)溶劑如DMSO儲存液需分裝成單次用量後，-20ºC避光(guāng)保存，避免反複凍融。

2）   為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法（僅作參考）

以下(xià)步驟是來源于大量文獻總結的簡易操作流程，僅作參考。用戶需根據特定的應用和敏感性來做調整。

1）   将低(dī)溫保存的凍幹粉取出回至室溫，低(dī)速離心使粉末落到(dào)瓶底。之後加入适量無水(shuǐ)DMSO或其他有機(jī)溶劑配制成1-10mM儲存液。未用完的DMSO儲存液需分裝并避光(guāng)凍存在-20℃，避免反複凍融。

2）   于正式實驗前，用生(shēng)理鹽緩沖液（比如：PBS，HBSS，HEPES）稀釋到(dào)工(gōng)作濃度1-10μM。需根據具體應用來調整合适的工(gōng)作濃度。

3）   吸走培養液，加入步驟2）配制的染色工(gōng)作液到(dào)細胞内，室溫或30℃孵育5~60min。

4）   吸走染色工(gōng)作液，用預熱的生(shēng)理緩沖液或細胞培養液清洗一(yī)遍。重新加入預熱的生(shēng)理緩沖液或細胞培養液，在适宜溫度内孵育。對于二乙酸酯衍生(shēng)物(wù)，需要短暫複原時間讓細胞内酯酶将其水(shuǐ)解，從(cóng)而讓染料對氧化應激産生(shēng)反應。最佳的複原時間範圍很廣，由于某些細胞類型通(tōng)常顯示極其低(dī)水(shuǐ)平的酯酶活性。

5）   将細胞暴露于實驗刺激物(wù)之前，先測定加載細胞的背景熒光(guāng)強度。

6）   根據以下(xià)情況評估陰性對照(zhào)（Negative control），

6.1 綠色發射光(guāng)譜内檢查未染色細胞的自(zì)熒光(guāng)情況。

6.2 對于流式分析，查明染料加載和處理後細胞的前向角散射和側向角散射是不變。細胞尺寸的變化可能(néng)與起泡或萎縮有關，由于處理或有毒反應引起的。

6.3 對包含和不包含刺激物(wù)的染料和緩沖液/培養基的無細胞混合物(wù)進行熒光(guāng)檢測。在不含細胞外酯酶和其他氧化酶的情況下(xià)，随著(zhe)時間熒光(guāng)的逐漸增加可能(néng)與瞬間水(shuǐ)解、空氣氧化、和/或光(guāng)誘導氧化有關。

6.4 檢查培養在生(shēng)長(cháng)培養液或簡單緩沖液内的未處理加載細胞（對照(zhào)）的熒光(guāng)。在健康細胞内，細胞内酶和/或天然抗氧化劑會(huì)清除這些氧自(zì)由基。經過染料加載複原時間後，健康細胞應該表現出低(dī)水(shuǐ)平的熒光(guāng)信号，且在整個(gè)實驗期間相(xiàng)對穩定。然而，逐漸增加（由于自(zì)氧化）或降低(dī)（由于細胞内染料喪失或光(guāng)淬滅）也有可能(néng)觀察到(dào)。在不含任何刺激物(wù)或誘導劑的體系内，健康和未處理細胞突然發現強熒光(guāng)，表明細胞發生(shēng)死亡或一(yī)些其他的氧化事(shì)件(jiàn)。

7）   建立陽性對照(zhào)（Positive control），可能(néng)用以下(xià)方法刺激氧化活性：

7.1 腫瘤促進劑（PMA，工(gōng)作濃度100pM~10μM）

7.2 H2O2或TBHP（終濃度~100μM）（根據細胞本身對其的靈敏度和反應性來提高(gāo)或降低(dī)濃度）

8）   确保刺激藥物(wù)或化合物(wù)不會(huì)引起染料熒光(guāng)淬滅。檢查化合物(wù)的吸收光(guāng)譜，确定化合物(wù)的吸收峰不會(huì)與氧化後染料的最大激發或發射光(guāng)譜發生(shēng)重疊。

相(xiàng)關産品

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引用文獻

【1】

Ma W, Chen X, Fu L, et al. Ultra-efficient Antibacterial System Based on Photodynamic Therapy and CO Gas Therapy for Synergistic Antibacterial and Ablation Biofilms. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(20):22479-22491. doi:10.1021/acsami.0c01967

Variation of ROS and H2O2 level in E. coli after CO release was respectively measured by

DCFH-DA (10 μΜ) and ROSGreenTM H2O2 Probe (5 μM) using the parallel method. The λEx and λEm for DCFH-DA were 505 and 535 nm, respectively, while that for ROSGreenTM H2O2 Probe were 490 and 525 nm, respectively. DCFH-DA and ROSGreenTM H2O2 Probe were purchased from Maokang Co., Ltd. (Shanghai,China).