Calcein, AM 鈣黃綠素（綠色，活細胞熒光(guāng)探針）

（标簽：超純HPLC≥97%，50μg單支銷售，普遍應用）

産品關鍵詞：

Calcein, AM, Ultra Pure Grade 鈣黃綠素（綠色）；活細胞探針；BCECF-AM；CFDA；碘化丙啶PI；細胞核探針；CAS：148504-34-1；

基本描述：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一(yī)種具細胞膜滲透性的活細胞熒光(guāng)染料，呈綠色熒光(guāng)（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團的存在不僅加強疏水(shuǐ)性，使其能(néng)輕易穿透活細胞膜。而且封閉結合鈣離子的分子部分，本身不發熒光(guāng)。一(yī)旦進入細胞後，被細胞内酯酶水(shuǐ)解為(wèi)鈣黃綠素（calcein），能(néng)與胞内鈣離子結合，産生(shēng)強烈的綠色熒光(guāng)。因不具有細胞膜滲透性，從(cóng)而被保留在胞内。與其它活細胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相(xiàng)比，Calcein, AM最适合用于活細胞染色探針，因細胞毒性很低(dī)，而且不會(huì)抑制任何細胞功能(néng)如增殖或淋巴細胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實驗結果十分可信，與标準的51Cr釋放(fàng)法所得結果一(yī)緻。

最顯著特征：

隻對活細胞進行染色，且細胞毒性極低(dī)，結果準确性高(gāo)，是最适合的活細胞染色探針。

常與死細胞核探針碘化丙啶PI聯合标記，進行活細胞-死細胞的雙重染色實驗。【見(jiàn)下(xià)：活細胞-死細胞雙重染色步驟】

應用圖片：

文獻1：Yoshinori Hiraoka et al. Rapid Assessment of the Physiological Status of the Polychlorinated Biphenyl Degrader Comamonas testosteroni TK102 by Flow Cytometry. Appl Environ Microbiol. 2002 Apr; 68(4): 2031–2035.

圖1：睾丸酮叢毛單胞菌（C. testosteroni）菌株TK102經Calcein, AM，PI雙染後的熒光(guāng)顯微檢測圖片。（A）活細胞，僅有綠色熒光(guāng)；（B）死細胞，僅有紅(hóng)色熒光(guāng)；（C）透化處理細胞，中心是紅(hóng)色熒光(guāng)，外緣是綠色熒光(guāng)。

文獻2：Mahto SK et al. Microfluidic shear stress-regulated surfactant secretion in alveolar epithelial type II cells in vitro. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2014 Apr 1;306(7):L672-83.

 圖2: effects of fluid shear stress on cell viability. MLE-12 (i) and A549 (ii) cells subjected to a maximal flow rate of 100 μl/min for 20 min were tested for viability using fluorescent dyes, calcein acetoxymethyl (AM) in green and propidium iodide in red (see arrows).

産品特性：

1）  CAS NO：148504-34-1

2）  同義名：鈣黃綠素乙酰甲酯；3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基熒光(guāng)素，二乙酰甲酯；

3）  分子式：C46H46N2O23

4）  分子量：994.86

5）  純度：≥97%（HPLC）

6）  外觀：白(bái)色或淺黃色結晶粉末

7）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

8）  化學結構式：  

活細胞-死細胞雙重染色步驟：

1. 儲存液制備

1）Calcein, AM——若使用的工(gōng)作液為(wèi)2μM，那麽可配制2mM的儲存液（1000×），即往50μg Calcein, AM（Mw：994.86）内加入25μl細胞培養級别的DMSO（貨号：MS4601-100mL）即可。-20℃幹燥保存。

2）PI——用1ml去離子水(shuǐ)溶解1mg PI，制備成1.5mM的儲存液（1mg/ml in H2O）。-20℃幹燥保存。

2. 染色工(gōng)作液制備

取5µlCalcein-AM溶液（2 mM）和15µlPI溶液（1.5 mM）加入5ml 1× PBS或HBSS-Hepes緩沖液，充分混勻。此時得到(dào)Calcein-AM的工(gōng)作液濃度為(wèi)2μM，PI的工(gōng)作液濃度為(wèi)4.5μM。【注意】：由于不同細胞系的最佳染色條件(jiàn)不同，初次實驗建議做梯度實驗，以确定Calcein, AM的最佳工(gōng)作濃度，以最低(dī)的探針濃度得到(dào)最好的熒光(guāng)結果為(wèi)篩選原則。

3. 染色步驟

1）對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。

2）去上(shàng)清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

3）用1× PBS或HBSS-Hepes緩沖液制備細胞懸液，使其密度為(wèi)105~106細胞/ml。

4）取100µl染色工(gōng)作液加入200µl細胞懸液内，混勻，37℃孵育15min。【注意】：如果需要，可延長(cháng)孵育時間至30min。

5）在蓋玻片上(shàng)滴加适量染色後的細胞懸液。熒光(guāng)顯微鏡下(xià)使用490±10 nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光(guāng)）以及死細胞（紅(hóng)色熒光(guāng)）。另外，使用545nm的發射濾片僅能(néng)觀察到(dào)死細胞。也可以直接在熒光(guāng)酶标儀下(xià)使用合适的濾片進行檢測。

【注意】：熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察時，如果背景高(gāo)，可以用培養基清洗掉細胞外的染料後再觀察；Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一(yī)起染色，也可以分開(kāi)進行染色，加入的先後順序沒有影響。

【注意】：可以使用以下(xià)方法來優化得到(dào)兩種熒光(guāng)染料的最佳工(gōng)作濃度。

1）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高(gāo)辛孵育細胞10min，或者用70%乙醇孵育細胞30min，從(cóng)而制備死細胞；

2）用0.1-10µM的PI溶液進行死細胞染色，以得到(dào)僅僅對細胞核染色，而不會(huì)對細胞質染色的最佳工(gōng)作濃度。

3）用0.1-10µM的Calcein-AM進行死細胞染色，以得到(dào)不會(huì)對細胞質染色的最佳工(gōng)作濃度。然後用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能(néng)被染色。

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