Alamar Blue 阿爾瑪藍細胞增殖及毒性檢測試劑

産品标簽

細胞增殖和毒性檢測（Cell proliferation and cytotoxicity）；MTT 噻唑蘭；CCK-8；WST-1；EdU 5-乙炔基-2’-脫氧尿苷；

産品信息

【溫馨提示】：見(jiàn)我司（懋康生(shēng)物(wù)）整理的阿爾瑪藍最佳孵育時間和細胞密度的使用示例。

【溫馨提示】：見(jiàn)我司（懋康生(shēng)物(wù)）整理的阿爾瑪藍測定LD50的方法。

【溫馨提示】：見(jiàn)我司（懋康生(shēng)物(wù)）整理的阿爾瑪藍常見(jiàn)問題（FAQs）。

【溫馨提示】：見(jiàn)我司（懋康生(shēng)物(wù)）整理的阿爾瑪藍常見(jiàn)應用推薦文獻。

産品描述

阿爾瑪藍（Alamar Blue）是一(yī)種細胞活力檢測試劑，包含一(yī)種具細胞膜滲透性、無毒性且弱藍色熒光(guāng)的指示劑，即刃天青（resazurin）。自(zì)從(cóng)1993年(nián)開(kāi)始刃天青就(jiù)作為(wèi)一(yī)種值得信賴和可靠的試劑被引用。阿爾瑪藍是MTT（噻唑蘭）的有效且無毒替代物(wù)。阿爾瑪藍能(néng)定量檢測人、哺乳動物(wù)、細菌、真菌和支原體細胞的增殖情況，也能(néng)用于細胞因子生(shēng)物(wù)活性、細胞活力分析、體外細胞毒性确定以及細胞生(shēng)長(cháng)監測。

阿爾瑪藍的工(gōng)作原理在于：刃天青是一(yī)種氧化還(hái)原（REDOX）指示劑，根據細胞代謝還(hái)原情況發生(shēng)顔色變化。氧化态的刃天青呈紫藍色且基本無熒光(guāng)，其還(hái)原态産物(wù)試鹵靈（resorufin）轉變為(wèi)粉紅(hóng)色且高(gāo)度熒光(guāng)，産生(shēng)的熒光(guāng)強度與呼吸活細胞數量呈正比。通(tōng)過檢測呼吸過程中氧化水(shuǐ)平，阿爾瑪藍用作一(yī)種定量檢測細胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍的顔色變化可通(tōng)過普通(tōng)分光(guāng)光(guāng)度計檢測吸光(guāng)度變化，檢測波長(cháng)為(wèi)570nm，參考波長(cháng)為(wèi)600nm；阿爾瑪藍的熒光(guāng)變化可通(tōng)過熒光(guāng)光(guāng)度計檢測，激發波長(cháng)在530~560nm之間，發射波長(cháng)為(wèi)590nm。

與台盼藍、TTC、MTT、MTS等分析法相(xiàng)比，阿爾瑪藍為(wèi)單一(yī)試劑，可連續快速的檢測細胞的增殖情況。阿爾瑪藍對細胞無毒無害，不會(huì)幹擾電(diàn)子傳遞鏈，不會(huì)幹擾細胞呼吸或功能(néng)，也不會(huì)影響細胞的抗體合成與分泌等活性，因此适用于對同一(yī)批細胞的增殖情況進行連續觀察和更進一(yī)步的觀察，具有操作簡便和幾乎不幹擾正常代謝的特征。

保存與運輸方法

保存：4℃避光(guāng)保存，至少一(yī)年(nián)有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1. 還(hái)原态的Alamar Blue在水(shuǐ)或水(shuǐ)溶性緩沖液如PBS中很不穩定，但在培養基内非常穩定。為(wèi)了确定特定實驗還(hái)原态Alamar Blue的吸光(guāng)度/熒光(guāng)值，需準備100%還(hái)原态Alamar Blue試劑：将Alamar Blue與細胞培養基按照(zhào)1:10的比例混合，高(gāo)壓滅菌15min即可。

2. 适宜的細胞密度能(néng)夠增加檢測靈敏度。對于96孔闆，建議每孔接種100μl細胞，細胞濃度範圍：貼壁細胞為(wèi)100-10,000個(gè)/孔，懸浮細胞在2,000-50,000個(gè)/孔，以培養基為(wèi)空白(bái)對照(zhào)。對于384孔闆，細胞濃度和接種量均減半。

3. 影響細胞對Alamar Blue反應的兩大變量為(wèi)孵育時間和鋪闆密度，建議實驗前需先摸索優化這兩個(gè)因素。細胞密度過高(gāo)或孵育時間過長(cháng)都會(huì)導緻繼發性還(hái)原反應，紅(hóng)色産物(wù)停止增加并開(kāi)始衰減，導緻吸光(guāng)度/熒光(guāng)水(shuǐ)平明顯下(xià)跌并伴随紅(hóng)色消失。

4. 微生(shēng)物(wù)污染會(huì)還(hái)原Alamar Blue。因此對被污染細胞使用Alamar Blue檢測會(huì)引起錯(cuò)誤結果。

5. Alamar Blue可以用分光(guāng)光(guāng)度計或熒光(guāng)計檢測，但熒光(guāng)靈敏度高(gāo)，實驗誤差小(xiǎo)，推薦熒光(guāng)檢測。

6. 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

一(yī)、标準曲線制作（最佳孵育時間和細胞密度的測定）

1. 收集對數生(shēng)長(cháng)期的細胞并進行細胞計數。每孔接種100μl細胞懸液，按比例依次用培養基等比稀釋成濃度梯度，一(yī)般做3-5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度做3-6個(gè)複孔。注意要設置陰性對照(zhào)（細胞培養基中不加入細胞）和陽性對照(zhào)（隻加100μl 100%還(hái)原态Alamar Blue，不含細胞）。

2. 每孔加入10μlAlamar Blue，陽性對照(zhào)孔加入10μl無菌超純水(shuǐ)。

3. 将平闆放(fàng)回細胞培養箱孵育。接下(xià)來的6-8h内每隔1h取出平闆并測定熒光(guāng)/吸光(guāng)值。建議平闆孵育過夜并測定第24h的熒光(guāng)/吸光(guāng)值，得到(dào)以下(xià)兩組數據：

a）在任何選定的孵育時間内，與細胞數量相(xiàng)關的細胞密度對Alamar Blue還(hái)原水(shuǐ)平通(tōng)過線性反應來确定；

b）在任何選定的細胞密度上(shàng)，測定随著(zhe)對照(zhào)細胞所需時間将Alamar Blue從(cóng)氧化态（藍色）轉化為(wèi)完全還(hái)原态（紅(hóng)色）來确定所需的孵育時間；

4.推薦用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計檢測，激發光(guāng)波長(cháng)在530-560 nm之間，發射光(guāng)波長(cháng)為(wèi)590 nm。或者用普通(tōng)分光(guāng)光(guāng)度計在570nm測定吸光(guāng)值，參考波長(cháng)600nm。也可用570/630nm和540/600nm替代。

5.計算(suàn)在每個(gè)特定細胞密度或孵育時間上(shàng)Alamar Blue的還(hái)原率。

a）公式1：通(tōng)過吸光(guāng)值來計算(suàn)還(hái)原率

Alamar Blue還(hái)原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-（E600′×C570）] ×100

E600=氧化态Alamar Blue在600nm波長(cháng)的消光(guāng)系數；

E570=氧化型Alamar Blue在570nm波長(cháng)的消光(guāng)系數；

A600=檢測孔在600nm波長(cháng)的吸光(guāng)值；

A570=檢測孔在570nm波長(cháng)的吸光(guāng)值；

E570′=還(hái)原态Alamar Blue在570nm波長(cháng)的消光(guāng)系數；

E600′=還(hái)原态Alamar Blue在600nm波長(cháng)的消光(guāng)系數；

C570=陰性對照(zhào)孔在570nm波長(cháng)的吸光(guāng)值（不加細胞的培養基+Alamar Blue）；

C600=陰性對照(zhào)孔在600nm波長(cháng)的吸光(guāng)值（不加細胞的培養基+Alamar Blue）；

表1. 阿爾瑪藍（Alamar Blue）在不同波長(cháng)下(xià)的消光(guāng)系數

b）公式2：通(tōng)過熒光(guāng)值來計算(suàn)還(hái)原率

Alamar Blue還(hái)原率（％）=（實驗組FI 590-陰性對照(zhào)組FI 590）/（100%還(hái)原态Alamar Blue陽性對照(zhào)FI 590-陰性對照(zhào)組FI 590）×100

FI 590=590nm發射波長(cháng)（560nm激發波長(cháng)）下(xià)的熒光(guāng)強度；

6. 繪制在每個(gè)特定細胞密度或孵育時間Alamar Blue的還(hái)原率。

a）對确定最佳細胞密度的實驗，以細胞密度的對數（log）為(wèi)x坐标，Alamar Blue還(hái)原率為(wèi)縱坐标；

b）對确定最佳孵育時間的實驗，以孵育時間為(wèi)x坐标，Alamar Blue還(hái)原率為(wèi)縱坐标；

c）根據以上(shàng)曲線圖來确定最佳細胞密度或孵育時間。

二、細胞毒性和細胞增殖檢測

1.收集對數生(shēng)長(cháng)期的細胞并進行細胞計數。調整細胞數為(wèi)1×104個(gè)/ml（建議細胞密度），每孔接種100μl細胞懸液。最佳細胞密度需根據細胞類型決定。

2.細胞鋪闆，并加入待檢測藥物(wù)。為(wèi)了确定藥物(wù)對細胞生(shēng)長(cháng)影響，需設置合适的對照(zhào)組，包括刺激和無刺激細胞組。

3.振蕩混勻，放(fàng)入細胞培養箱内孵育一(yī)段時間。

4.無菌條件(jiàn)下(xià)每孔加入10μlAlamar Blue。陽性對照(zhào)孔中加入10μl無菌的超純水(shuǐ)。

5.放(fàng)入細胞培養箱内孵育4-8h，最佳孵育時間取決于細胞類型。

6.使用光(guāng)度計測定細胞毒性或增殖情況。

7.推薦用熒光(guāng)分光(guāng)光(guāng)度計檢測，激發光(guāng)波長(cháng)在530-560 nm之間，發射光(guāng)波長(cháng)為(wèi)590 nm。或者用普通(tōng)分光(guāng)光(guāng)度計在570nm測定吸光(guāng)值，參考波長(cháng)600nm。使用培養基為(wèi)空白(bái)對照(zhào)。

8.計算(suàn)細胞毒性和增殖實驗下(xià)對照(zhào)細胞和處理細胞間Alamar Blue還(hái)原度的變化百分比。

a）公式3：通(tōng)過吸光(guāng)值來計算(suàn)還(hái)原度的變化百分比

Alamar Blue還(hái)原度變化百分比（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[( E600×P570)-（E570×P600）] ×100

E600=氧化态Alamar Blue在600nm波長(cháng)的消光(guāng)系數；

E570=氧化态Alamar Blue在570nm波長(cháng)的消光(guāng)系數；

A600=檢測孔在600nm波長(cháng)的吸光(guāng)值；

A570=檢測孔在570nm波長(cháng)的吸光(guāng)值；

P570=陽性對照(zhào)孔在570nm波長(cháng)的吸光(guāng)值（不含待測藥物(wù)的細胞+ Alamar Blue）

P600=陽性對照(zhào)孔在600nm波長(cháng)的吸光(guāng)值（不含待測藥物(wù)的細胞+ Alamar Blue）

表1. 阿爾瑪藍（Alamar Blue）在不同波長(cháng)下(xià)的消光(guāng)系數

結果判斷：假如Alamar Blue還(hái)原度變化百分比（％）=62%，說明相(xiàng)對于對照(zhào)孔，檢測孔Alamar Blue的還(hái)原變化值為(wèi)62%，換句話而言，相(xiàng)對于對照(zhào)孔，38%的檢測孔細胞生(shēng)長(cháng)受到(dào)抑制。

b）公式4：通(tōng)過熒光(guāng)值來計算(suàn)還(hái)原度的變化百分比

Alamar Blue還(hái)原度變化百分比（％）=實驗組FI 590/陰性對照(zhào)組FI 590）×100

FI 590=590nm發射波長(cháng)（560nm激發波長(cháng)）下(xià)的熒光(guāng)強度；

結果判斷：假如Alamar Blue還(hái)原度變化百分比（％）=25%，說明相(xiàng)對于對照(zhào)孔，檢測孔Alamar Blue的還(hái)原變化值為(wèi)25%，換句話而言，相(xiàng)對于對照(zhào)孔，75%的檢測孔細胞生(shēng)長(cháng)受到(dào)抑制。

相(xiàng)關産品

文獻引用

[1]

Wang Lixuan et al. Fabrication of Injectable, Porous Hyaluronic Acid Hydrogel Based on an In-Situ Bubble-Forming Hydrogel Entrapment Process. Polymers 2020, 12(5), 1138; https://doi.org/10.3390/polym12051138

Alamar Blue was bought from Maokang Biotechnology Co., Ltd., (Shanghai, China). 

To detect cytotoxicity and cell proliferation, the rBMSC suspension was added to the wells from the top of the scaffold, and culturing took place in a cell incubator at 37 °C for 1, 4, or 7 days. After the end of the culturing, we added Alamar blue reagent to the well plate and continued incubating in the cell incubator for 2–8 h until the color of the culture medium changed from blue to pink. Finally, the fluorescence intensity which is directly proportional to the number of viable cells was measured by a fluorescence photometer (SAFIRE, Tecan Co., Mannedorf, Switzerland). 

[2]

Xiangyun Niu et al. Effects of Pinus massoniana pollen polysaccharides on intestinal microenvironment and colitis in mice. Food Funct., 2021,12, 252-266 https://doi.org/10.1039/D0FO02190C

After 20μl of Alamar Blue™ solution (Maokang Biotechnology, China) was added to each well, the cells were then continuously cultured for 5–24 h.

32.

[1]YAN, Wensheng; JIANG, Lingjun  and  XU, Jifen. Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja polysaccharides alleviate type 2 diabetes mellitus in rats by resisting inflammatory response and oxidative stress. Food Sci. Technol [online]. 2020, vol.40, suppl.1 [cited  2020-07-24], pp.158-162.

Streptozotocin was provided by Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Sixty rats were single-cage raised in the condition avoiding strong light and noise (temperature 22 ± 2 °C; humidity 40-70%; [2]12/12-h day-night cycle; free to feed and water). After one week of adaptive feeding, 10 rats were randomly selected as the control group, which were fed with standard diet. The remaining 50 rats were fed with high-fat and high-sugar diet (20% sucrose, 18% lard, 3% yolk and 59% basic diet) for 4 weeks. The rats were fasted for 12 h, followed by single intraperitoneal injection of streptozotocin solution with dose of 30 mg/kg. After 72 h, the blood sample was taken from tail vein, and the fasting blood glucose (FBG) was detected. The FBG > 16.7 mmol/L presented the successful establishment of T2DM model.

 — — Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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