CCK-8 Frequently Asked Questions:

1. CCK-8與其他細胞增殖-毒性檢測方法的優勢在哪裡(lǐ)？

2. 單孔接種多(duō)少個(gè)細胞？

當使用96孔闆時，貼壁細胞的最小(xiǎo)接種量至少為(wèi)1000個(gè)/孔（100μL培養基）。檢測白(bái)細胞的靈敏度相(xiàng)對較低(dī)，因此建議接種量不低(dī)于2500個(gè)/孔（100μL培養基），建議先做幾個(gè)孔摸索接種細胞的數量。若使用24孔闆或6孔闆，請先計算(suàn)每孔相(xiàng)應的接種量，然後按照(zhào)每孔培養基總體積的10%加入CCK-8。

3. 如何設定空白(bái)對照(zhào)？

在不含細胞的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光(guāng)度即為(wèi)空白(bái)對照(zhào)。在做加藥實驗（細胞毒性實驗）時，還(hái)應考慮藥物(wù)的吸收，可以在不含細胞、加入藥物(wù)的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光(guāng)度作為(wèi)空白(bái)對照(zhào)。

4. 哪些物(wù)質會(huì)影響CCK-8的測定？

當有還(hái)原性物(wù)質存在時會(huì)增加CCK-8的測定，增加OD值；當有氧化性物(wù)質存在時會(huì)抑制測定反應的發生(shēng)，降低(dī)OD值。在有酚紅(hóng)存在的情況下(xià)，會(huì)增加空白(bái)吸收，但不影響測定，扣除空白(bái)吸收即可。

5. 做加藥實驗時，藥物(wù)對測定是否有影響？如何解決？

有時會(huì)有影響。如果藥物(wù)具有還(hái)原性就(jiù)會(huì)和CCK-8發生(shēng)顯色反應，增加OD值。解決方法：首先要确認藥物(wù)是否有吸收，在含有藥物(wù)的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光(guāng)度。如果它的吸光(guāng)度比不含藥物(wù)的培養基（隻加CCK-8）的吸光(guāng)度高(gāo)，則說明藥物(wù)有影響，可在加CCK-8之前更換培養基，去掉藥物(wù)的影響。

6.   CCK-8對細胞的毒性大小(xiǎo)如何？

CCK-8對細胞毒性相(xiàng)當低(dī)，同樣的細胞在CCK-8檢測後還(hái)可用于其他細胞增殖的檢測實驗，比如結晶紫檢測法，中性紅(hóng)檢測法或DNA熒光(guāng)檢測法等。由于每種細胞對CCK-8的耐受力不同，因此若需要長(cháng)時間孵育，先檢測下(xià)細胞在加入CCK-8後的活力。

7. 如果沒有450nm的濾光(guāng)片，還(hái)可以使用哪些其他濾光(guāng)片？

還(hái)可使用430-490nm之間的濾光(guāng)片，但450nm濾光(guāng)片的檢測靈敏度最高(gāo)。

8. CCK-8能(néng)否對活細胞進行染色？

不能(néng)。因為(wèi)CCK-8的主要成分是一(yī)種水(shuǐ)溶性四唑鹽（WST-8），并通(tōng)過電(diàn)子載體1-methoxy PM将活細胞中的電(diàn)子交換到(dào)培養基中的WST-8上(shàng)，因WST-8及其生(shēng)成的甲臢染料是高(gāo)度水(shuǐ)溶性的，不會(huì)進入細胞内，所以CCK-8不能(néng)對活細胞進行染色。

9.  須設定參比波長(cháng)？設定參比波長(cháng)的目的是什麽？

不一(yī)定，CCK-8在參比波長(cháng)處沒有吸光(guāng)度。設定參比波長(cháng)的目的是為(wèi)了去除由于樣品渾濁産生(shēng)的吸收。

10. 每次測定的數值不一(yī)樣，是什麽原因？如何解決？

可能(néng)存在以下(xià)幾個(gè)原因：a）當在培養箱内培養時，培養闆最外一(yī)圈的孔最容易幹燥揮發，由于體積不準确而增加誤差。通(tōng)常情況最外一(yī)圈孔隻加培養基，不作為(wèi)測定孔用；b）有可能(néng)因為(wèi)CCK-8沾在壁上(shàng)而産生(shēng)誤差，建議在加入CCK-8，輕輕敲擊培養闆以幫助混勻；c）每孔的細胞數量過多(duō)或過少。請預先在1000~100,000個(gè)/孔範圍内摸索條件(jiàn)。

11. 如果OD值太低(dī)，可以采取什麽辦法？

可采取2種辦法：a）适當增加細胞數量；b）延長(cháng)加入CCK-8後的孵育時間。

12. 如果OD值太高(gāo)，但不能(néng)減少細胞數量，如何解決？

可以縮短加入CCK-8後的孵育時間。比如，可以把加入CCK-8後的孵育時間由原來的3h縮短到(dào)2h。

13. CCK-8顯色過程種如何終止反應？

有以下(xià)幾種方法（96孔闆）：a）顯色反應後，将培養闆置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反應終止後請在24h内測定OD值。

14. 必須預培養細胞嗎(ma)？

不一(yī)定。如果需要保持細胞的最佳狀态，建議預培養細胞。如果不做預培養，細胞内的脫氫酶可能(néng)會(huì)不穩定。有的科研人員(yuán)不做預培養，但做标準曲線和檢測時需要統一(yī)檢測條件(jiàn)。

15. 預培養後，更換培養基需要細胞計數嗎(ma)？

一(yī)般情況下(xià)用胰蛋白(bái)酶處理對數增長(cháng)期的細胞，用血球計數闆計數，制備成一(yī)定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話，可以預培養後取培養基用血球計數闆進行計數。

16. CCK-8對于不同的細胞靈敏度是否一(yī)樣？

不一(yī)樣。懸浮細胞相(xiàng)比較難染色。對于貼壁細胞，一(yī)般加入CCK-8後1-4h吸光(guāng)度已經很高(gāo)，但對于懸浮細胞則可能(néng)吸光(guāng)度較低(dī)，可以通(tōng)過延長(cháng)CCK-8的染色時間或增加細胞數量來解決。

17. 懸浮細胞和貼壁細胞在數量上(shàng)有何區别？

懸浮細胞由于染色比較困難，一(yī)般需要增加細胞數量和延長(cháng)培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光(guāng)度會(huì)超過酶标儀的讀(dú)數。 

18. 應該每次做标準曲線嗎(ma)？

建議每次都做。雖然細胞相(xiàng)同，但是細胞狀态不一(yī)樣。對于狀态不一(yī)樣的細胞建議每次做标準曲線。如果試劑的批号不一(yī)樣，靈敏度可能(néng)有輕微的差異，此時也建議分别做标準曲線。

19. 實驗之前是否需要先檢測以下(xià)培養基和CCK-8之間是否有反應？

建議使用一(yī)個(gè)孔做下(xià)檢測，因有時培養基種可能(néng)含氧化還(hái)原物(wù)質。正式實驗之前有必要先确認下(xià)培養基和CCK-8是否有反應。一(yī)般正常的OD值應該在0.4以下(xià)。

20. 有時在藥物(wù)作用下(xià)，細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還(hái)在，是否能(néng)計算(suàn)細胞數量？

不能(néng)。由于CCK-8是通(tōng)過和細胞内的脫氫酶進行反應間接反應活細胞數量。如果細胞已經死亡，即使脫氫酶的活性還(hái)有，測定出來的細胞數量将會(huì)比真實值高(gāo)，不能(néng)反應真實的活細胞數量，建議采用别的方法測定。

21. 可否使用384孔闆進行實驗？

可以。向每孔加入培養基總體積10%的CCK-8。如果加入CCK-8體積太少，可以先将CCK-8稀釋一(yī)倍，然後加入培養基總體積20%的量。

22. CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相(xiàng)關性？

有。但請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此，結果可能(néng)不同。

23. CCK-8能(néng)否檢測細菌細胞？

可以檢測大腸杆菌，但不能(néng)檢測酵母細胞。向每孔100μL大腸杆菌培養液中加入10μL CCK-8，培養1-4h或過夜。

24. 如果加入藥物(wù)中含有金屬，是否有影響？

金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為(wèi)1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅分别會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應，使得靈敏度降低(dī)。如果終濃度是10mM，将會(huì)100%抑制。

25. CCK-8的穩定性如何？

CCK-8在2-8℃能(néng)穩定保存1年(nián)，推薦用此方法檢測；長(cháng)期不用也可置于-20℃穩定保存2年(nián)。

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