Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑

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産品标簽

CCK-8細胞增殖及毒性檢測;WST-8；MTT 噻唑蘭；Alamar Blue 阿爾瑪藍；XTT；WST-1；

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質量控制：

産品描述

Cell Counting Kit (CCK-8)，中文名CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑，簡稱CCK-8試劑盒，是一(yī)種基于WST-8（化學名為(wèi)2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的一(yī)種廣泛應用于細胞增殖和毒性檢測的快速高(gāo)靈敏度試劑盒。

WST-8是MTT（噻唑蘭）的升級産品，檢測原理（見(jiàn)下(xià)圖）為(wèi)：在電(diàn)子耦合試劑存在的情況下(xià)，WST-8可被線粒體内的脫氫酶還(hái)原生(shēng)成高(gāo)度水(shuǐ)溶性的橙黃色的甲臜産物(wù)（formazan）。顔色的深淺與活細胞數量（細胞增殖）成正比，與細胞毒性成反比。通(tōng)過酶标儀在450nm波長(cháng)處測定OD值來反映細胞增殖，以及細胞毒性水(shuǐ)平。

CCK-8法應用非常廣泛，包括藥物(wù)篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生(shēng)物(wù)因子的活性檢測等。

保存與運輸方法

保存：2-8℃避光(guāng)保存，一(yī)年(nián)有效。-20℃避光(guāng)保存，二年(nián)有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）   第一(yī)次做實驗時，建議先做幾個(gè)孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑後的培養時間。

2）   接種時注意細胞懸液一(yī)定要混勻，以避免細胞沉澱下(xià)來導緻每孔中的細胞數量不等，可以每接種幾個(gè)孔就(jiù)混勻一(yī)下(xià)。培養闆周圍一(yī)圈孔培養基容易揮發，為(wèi)減少誤差，建議培養闆的四邊每孔隻加培養基，而不作為(wèi)指标檢測孔。

3）  培養時間根據細胞種類不同和每孔内細胞數量的多(duō)少而異。一(yī)般情況白(bái)細胞較難顯色，因此需要較長(cháng)的CCK-8反應時間或增大細胞數量（~105個(gè)細胞/孔）。懸浮細胞比貼壁細胞較難顯色，對于懸浮細胞，加入CCK-8培養1-4小(xiǎo)時後，可先從(cóng)培養箱中取出，目測染色程度或用酶标儀測定來決定。若顯色困難，可将培養闆放(fàng)回培養箱，繼續培養數小(xiǎo)時後再确定。對于貼壁細胞，CCK-8的培養時間一(yī)般為(wèi)1-4小(xiǎo)時，但培養30分鍾左右可取出肉眼觀察顯色程度（根據細胞類型而定，需要摸索一(yī)定條件(jiàn)）。注意：CCK-8的最佳反應時間以實際顯色的最佳時間為(wèi)準。

4）   有條件(jiàn)的情況下(xià)建議采用多(duō)通(tōng)道移液器(qì)，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時，建議斜貼著(zhe)培養闆壁加，不要插到(dào)培養基液面下(xià)加，容易産生(shēng)氣泡，會(huì)幹擾OD值讀(dú)數。

5）   加CCK-8速度要快，減少試劑在移液器(qì)上(shàng)的殘留。為(wèi)使CCK-8試劑和培養基充分混勻，建議在加入CCK-8後輕輕震搖培養闆。為(wèi)了避免加樣時由于CCK-8在槍頭上(shàng)殘留所引入的誤差，可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8并混勻後加樣。

6）   CCK-8的核心成分WST-8會(huì)與還(hái)原劑反應生(shēng)成WST-8甲臢，若實驗體系内含有還(hái)原劑，請務必檢測背景OD值（即在不含細胞的培養基中加入藥物(wù)，然後加入CCK-8在一(yī)定時間内檢測）和不加藥物(wù)的培養基（隻加CCK-8）進行比較。如果OD值明顯偏高(gāo)，則說明的确存在反應。

7）   若細胞培養時間較長(cháng)，培養基顔色發生(shēng)變化或pH發生(shēng)變化，建議更換新鮮的培養基後再加入CCK-8。含酚紅(hóng)的培養基不影響CCK-8測定細胞活性。

8）   如果樣品為(wèi)高(gāo)渾濁的細胞懸液，建議設定600nm（或600nm以上(shàng)）作為(wèi)參比波長(cháng)，扣除參比波長(cháng)的OD值即可。

9）   CCK-8對細胞毒性非常低(dī)，其與活細胞脫氫酶持續反應使溶液顔色不斷加深，OD值不斷增加（由于脫氫酶是持續産生(shēng)的）。另外，其他實驗比如中興紅(hóng)法或結晶紫法，也可在CCK-8檢測完成後繼續進行。

10）若需要測定細胞的具體數量，建議先做一(yī)個(gè)标準曲線。

11）如果沒有450nm的濾光(guāng)片，可以使用吸光(guāng)度在430-490 nm之間的濾光(guāng)片，但是450nm濾光(guāng)片的檢測靈敏度最高(gāo)。

12）關于CCK-8的更多(duō)問題，請見(jiàn)附錄I. CCK-8使用常見(jiàn)問題集錦。

13）為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

1.      制作标準曲線（測定細胞具體數量）

1）   先用細胞計數闆計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然後接種細胞到(dào)培養闆内。

2）   按比例（例如：1/2比例）依次用培養基等比稀釋成一(yī)個(gè)細胞濃度梯度，一(yī)般要做3-5個(gè)細胞濃度梯度，每個(gè)濃度建議3-6個(gè)複孔。

3）   接種後培養2-4小(xiǎo)時使細胞貼壁，然後加CCK-8試劑培養一(yī)定時間後測定OD值，制作出一(yī)條以細胞數量為(wèi)橫坐标（X軸），OD值為(wèi)縱坐标（Y軸）的标準曲線。根據此标準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（使用此标準曲線的前提是實驗的條件(jiàn)要一(yī)緻，便于确定細胞的接種數量以及加入CCK-8後的培養時間。）

2.      細胞活性檢測

1）   在96孔闆中接種細胞懸液（100μL/孔）。将培養闆放(fàng)在培養箱中預培養一(yī)段時間（37℃，5% CO2）。

2）   向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生(shēng)成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀(dú)數）。

3）   将培養闆在培養箱内孵育1-4小(xiǎo)時。

4）   用酶标儀測定在450nm處的吸光(guāng)度。

5）   若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養闆避光(guāng)保存在室溫條件(jiàn)下(xià)。24小(xiǎo)時内測定，吸光(guāng)度不會(huì)發生(shēng)變化。

3.      細胞增殖-毒性檢測

1）   在96孔闆中配制100μL的細胞懸液。将培養闆放(fàng)在培養箱預培養24小(xiǎo)時（37℃，5% CO2）。

2）   向培養闆加入10μL不同濃度的待測物(wù)質。

3）   将培養闆在培養箱孵育一(yī)段适當的時間（例如：6、12、24或48小(xiǎo)時）。

4）  向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生(shēng)成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀(dú)數）。

5）   将培養闆在培養箱内孵育1-4小(xiǎo)時。

6）   用酶标儀測定在450nm處的吸光(guāng)度。

7）   若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養闆避光(guāng)保存在室溫條件(jiàn)下(xià)。24小(xiǎo)時内測定，吸光(guāng)度不會(huì)發生(shēng)變化。

【注意】：如果待測物(wù)質有氧化性或還(hái)原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然後加入新的培養基），去掉藥物(wù)影響。當然藥物(wù)影響比較小(xiǎo)的情況下(xià)，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物(wù)後的空白(bái)吸收即可。

活力計算(suàn)

細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白(bái)）]/[A（0加藥）-A（空白(bái)）] ×100
A（加藥）：實驗孔（含有細胞的培養基、CCK-8溶液和藥物(wù)）的吸光(guāng)度
A（空白(bái)）：空白(bái)孔（不含細胞和藥物(wù)的培養基，含CCK-8溶液）的吸光(guāng)度
A（0加藥）：對照(zhào)孔（含有細胞的培養基、CCK-8溶液，不含藥物(wù)）的吸光(guāng)度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性

相(xiàng)關産品

附錄I. CCK-8使用常見(jiàn)問題集錦

1）  CCK-8與其他細胞增殖-毒性檢測方法的優勢在哪裡(lǐ)？

2）   單孔接種多(duō)少個(gè)細胞？

當使用96孔闆時，貼壁細胞的最小(xiǎo)接種量至少為(wèi)1000個(gè)/孔（100μL培養基）。檢測白(bái)細胞的靈敏度相(xiàng)對較低(dī)，因此建議接種量不低(dī)于2500個(gè)/孔（100μL培養基），建議先做幾個(gè)孔摸索接種細胞的數量。若使用24孔闆或6孔闆，請先計算(suàn)每孔相(xiàng)應的接種量，然後按照(zhào)每孔培養基總體積的10%加入CCK-8。

3）   如何設定空白(bái)對照(zhào)？

在不含細胞的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光(guāng)度即為(wèi)空白(bái)對照(zhào)。在做加藥實驗（細胞毒性實驗）時，還(hái)應考慮藥物(wù)的吸收，可以在不含細胞、加入藥物(wù)的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光(guāng)度作為(wèi)空白(bái)對照(zhào)。

4）   哪些物(wù)質會(huì)影響CCK-8的測定？

當有還(hái)原性物(wù)質存在時會(huì)增加CCK-8的測定，增加OD值；當有氧化性物(wù)質存在時會(huì)抑制測定反應的發生(shēng)，降低(dī)OD值。在有酚紅(hóng)存在的情況下(xià)，會(huì)增加空白(bái)吸收，但不影響測定，扣除空白(bái)吸收即可。

5）   做加藥實驗時，藥物(wù)對測定是否有影響？如何解決？

有時會(huì)有影響。如果藥物(wù)具有還(hái)原性就(jiù)會(huì)和CCK-8發生(shēng)顯色反應，增加OD值。解決方法：首先要确認藥物(wù)是否有吸收，在含有藥物(wù)的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光(guāng)度。如果它的吸光(guāng)度比不含藥物(wù)的培養基（隻加CCK-8）的吸光(guāng)度高(gāo)，則說明藥物(wù)有影響，可在加CCK-8之前更換培養基，去掉藥物(wù)的影響。

6）   CCK-8對細胞的毒性大小(xiǎo)如何？

CCK-8對細胞毒性相(xiàng)當低(dī)，同樣的細胞在CCK-8檢測後還(hái)可用于其他細胞增殖的檢測實驗，比如結晶紫檢測法，中性紅(hóng)檢測法或DNA熒光(guāng)檢測法等。由于每種細胞對CCK-8的耐受力不同，因此若需要長(cháng)時間孵育，先檢測下(xià)細胞在加入CCK-8後的活力。

7）   如果沒有450nm的濾光(guāng)片，還(hái)可以使用哪些其他濾光(guāng)片？

還(hái)可使用430-490nm之間的濾光(guāng)片，但450nm濾光(guāng)片的檢測靈敏度最高(gāo)。

8）   CCK-8能(néng)否對活細胞進行染色？

不能(néng)。因為(wèi)CCK-8的主要成分是一(yī)種水(shuǐ)溶性四唑鹽（WST-8），并通(tōng)過電(diàn)子載體1-methoxy PM将活細胞中的電(diàn)子交換到(dào)培養基中的WST-8上(shàng)，因WST-8及其生(shēng)成的甲臢染料是高(gāo)度水(shuǐ)溶性的，不會(huì)進入細胞内，所以CCK-8不能(néng)對活細胞進行染色。

9）   必須設定參比波長(cháng)？設定參比波長(cháng)的目的是什麽？

不一(yī)定，CCK-8在參比波長(cháng)處沒有吸光(guāng)度。設定參比波長(cháng)的目的是為(wèi)了去除由于樣品渾濁産生(shēng)的吸收。

10）每次測定的數值不一(yī)樣，是什麽原因？如何解決？

可能(néng)存在以下(xià)幾個(gè)原因：a）當在培養箱内培養時，培養闆最外一(yī)圈的孔最容易幹燥揮發，由于體積不準确而增加誤差。通(tōng)常情況最外一(yī)圈孔隻加培養基，不作為(wèi)測定孔用；b）有可能(néng)因為(wèi)CCK-8沾在壁上(shàng)而産生(shēng)誤差，建議在加入CCK-8，輕輕敲擊培養闆以幫助混勻；c）每孔的細胞數量過多(duō)或過少。請預先在1000~100,000個(gè)/孔範圍内摸索條件(jiàn)。

11）如果OD值太低(dī)，可以采取什麽辦法？

可采取2種辦法：a）适當增加細胞數量；b）延長(cháng)加入CCK-8後的孵育時間。

12）如果OD值太高(gāo)，但不能(néng)減少細胞數量，如何解決？

可以縮短加入CCK-8後的孵育時間。比如，可以把加入CCK-8後的孵育時間由原來的3h縮短到(dào)2h。

13）CCK-8顯色過程種如何終止反應？

有以下(xià)幾種方法（96孔闆）：a）顯色反應後，将培養闆置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反應終止後請在24h内測定OD值。

14）必須預培養細胞嗎(ma)？

不一(yī)定。如果需要保持細胞的最佳狀态，建議預培養細胞。如果不做預培養，細胞内的脫氫酶可能(néng)會(huì)不穩定。有的科研人員(yuán)不做預培養，但做标準曲線和檢測時需要統一(yī)檢測條件(jiàn)。

15）預培養後，更換培養基需要細胞計數嗎(ma)？

一(yī)般情況下(xià)用胰蛋白(bái)酶處理對數增長(cháng)期的細胞，用血球計數闆計數，制備成一(yī)定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話，可以預培養後取培養基用血球計數闆進行計數。

16）CCK-8對于不同的細胞靈敏度是否一(yī)樣？

不一(yī)樣。懸浮細胞相(xiàng)比較難染色。對于貼壁細胞，一(yī)般加入CCK-8後1-4h吸光(guāng)度已經很高(gāo)，但對于懸浮細胞則可能(néng)吸光(guāng)度較低(dī)，可以通(tōng)過延長(cháng)CCK-8的染色時間或增加細胞數量來解決。

17）懸浮細胞和貼壁細胞在數量上(shàng)有何區别？

懸浮細胞由于染色比較困難，一(yī)般需要增加細胞數量和延長(cháng)培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光(guāng)度會(huì)超過酶标儀的讀(dú)數。

18）應該每次做标準曲線嗎(ma)？

建議每次都做。雖然細胞相(xiàng)同，但是細胞狀态不一(yī)樣。對于狀态不一(yī)樣的細胞建議每次做标準曲線。如果試劑的批号不一(yī)樣，靈敏度可能(néng)有輕微的差異，此時也建議分别做标準曲線。

19）實驗之前是否需要先檢測以下(xià)培養基和CCK-8之間是否有反應？

建議使用一(yī)個(gè)孔做下(xià)檢測，因有時培養基種可能(néng)含氧化還(hái)原物(wù)質。正式實驗之前有必要先确認下(xià)培養基和CCK-8是否有反應。一(yī)般正常的OD值應該在0.4以下(xià)。

20）有時在藥物(wù)作用下(xià)，細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還(hái)在，是否能(néng)計算(suàn)細胞數量？

不能(néng)。由于CCK-8是通(tōng)過和細胞内的脫氫酶進行反應間接反應活細胞數量。如果細胞已經死亡，即使脫氫酶的活性還(hái)有，測定出來的細胞數量将會(huì)比真實值高(gāo)，不能(néng)反應真實的活細胞數量，建議采用别的方法測定。

21）可否使用384孔闆進行實驗？

可以。向每孔加入培養基總體積10%的CCK-8。如果加入CCK-8體積太少，可以先将CCK-8稀釋一(yī)倍，然後加入培養基總體積20%的量。

22）CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相(xiàng)關性？

有。但請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此，結果可能(néng)不同。

23）CCK-8能(néng)否檢測細菌細胞？

可以檢測大腸杆菌，但不能(néng)檢測酵母細胞。向每孔100μL大腸杆菌培養液中加入10μL CCK-8，培養1-4h或過夜。

24）CCK-8的穩定性如何？

CCK-8在2-8℃能(néng)穩定保存1年(nián)，推薦用此方法檢測；長(cháng)期不用也可置于-20℃穩定保存2年(nián)。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海夢澤生物科技有限公司是一(yī)家涉足于生(shēng)命科學和生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域研究的試劑、儀器(qì)和實驗室消耗品與實驗服務工(gōng)作，主要從(cóng)事(shì)細胞生(shēng)物(wù)學、植物(wù)學、分子生(shēng)物(wù)學、免疫學、生(shēng)物(wù)化學、蛋白(bái)組學。生(shēng)物(wù)制藥與診斷試劑研發生(shēng)産等領域。 本公司秉承“以人為(wèi)本，以誠為(wèi)信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為(wèi)廣大客戶提供優質産品。

文獻引用：

Liu JY et al. 3D printing of biomimetic multi-layered GelMA/nHA scaffold for osteochondral defect repair. Materials & Design Volume 171, 5 June 2019, 107708

Cell counting kit-8 reagent was purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (China). Cell proliferation on the scaffold was measured with CCK-8 after 1, 3, 5 and 7 days of culture, and cell culture plates were used as blank group. The BMSCs-seeded hydrogels were incubated in DMEM containing 10% CCK-8 protected from light at an incubator of 37 °C and 5% CO2 for 4 h, and measured at 450 nm using a microplate reader.