Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry

細胞表面抗原免疫熒光(guāng)染色（流式分析）

産品标簽：

Cell surface antigen 細胞表面抗原；RBC Lysis Buffer 紅(hóng)細胞裂解液；TruStain FcX™ Fc受體封閉劑；Flow cytometry（FC）流式分析；cell staining buffer 細胞染色緩沖液；

背景描述：

通(tōng)過熒光(guāng)标記抗體和流式細胞術(shù)檢測，細胞表面标記（Cell surface marker）能(néng)夠用來确定細胞亞群，基于來源，發育階段和功能(néng)。這些表面标記呈現不同形式和功能(néng)，包括識别可溶性和細胞連接配體的受體，離子通(tōng)道，糖蛋白(bái)，磷脂等。比如CD4是輔助性T細胞（Th細胞）的表面标記，基于其他趨化因子受體和白(bái)細胞分化抗原标記能(néng)進一(yī)步被分類鑒定。

細胞表面抗原免疫熒光(guāng)染色-流式分析步驟：

此步驟做交流學習用，具體的實驗方案因實驗而異。

A．組織和細胞收集

1.   收集理想組織（如脾髒、淋巴結、胸腺、骨髓）并制備懸浮于細胞染色緩沖液（cell staining buffer）的單細胞懸液。如果使用體外刺激細胞，隻需将刺激活化的細胞簡單懸浮于細胞染色緩沖液（cell staining buffer）。

2.   加細胞染色緩沖液（cell staining buffer）高(gāo)達~15ml，然後350xg離心5min，吸掉上(shàng)清。

B．紅(hóng)細胞裂解

3.   用3ml紅(hóng)細胞裂解液（1× RBC Lysis Buffer）重懸細胞或根據具體情況加入相(xiàng)應量的紅(hóng)細胞裂解液。冰上(shàng)孵育5min。

4.   加10ml細胞染色緩沖液（cell staining buffer）到(dào)管内終止細胞裂解，然後350xg離心5min，吸掉上(shàng)清。

5.   如步驟2重複一(yī)次清洗。

6.   細胞計數，用細胞染色緩沖液沖重懸細胞使濃度為(wèi)5-10 x 106cells/ml，按照(zhào)100µl/管分裝細胞懸液到(dào)12 x 75mm塑料管中（5-10 x 105cells/ml）。

C．Fc受體封閉

7.   阻斷Fc受體的試劑适用于降低(dī)非特異性免疫熒光(guāng)染色。小(xiǎo)鼠樣本，使用特異性結合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗體可用于封閉抗體的非特異性染色。此種情況下(xià)，100 µl染色體積按照(zhào)每106個(gè)細胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗體，混勻，冰上(shàng)孵育5-10min。

8.  人樣本，每100 µl染色體積加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution，Fc受體封閉劑)，混勻，室溫孵育5-10min。在不含有有效/可得的封閉抗體情況下(xià)，使用過量的相(xiàng)同物(wù)種來源的純化IgG和免疫熒光(guāng)染色用抗體相(xiàng)同來源的IgG亞型作為(wèi)替代方法來封閉細胞。

D．抗體的細胞表面染色

9.   按照(zhào)預先優化的濃度，加入合适的熒光(guāng)素、生(shēng)物(wù)素偶聯抗體或純化的一(yī)抗（如：anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC），冰上(shàng)避光(guāng)孵育15-20min。

10.  至少使用2ml細胞染色緩沖液（cell staining buffer）清洗細胞，350xg離心5min，吸掉上(shàng)清。重複一(yī)次。

11.  如果使用純化的一(yī)抗，需在殘留的緩沖液中重懸細胞，加入預先優化濃度的熒光(guāng)二抗，冰上(shàng)避光(guāng)孵育15-20min。

12.  重複步驟10。

13.  用0.5ml細胞染色緩沖液（cell staining buffer）重懸細胞，每106個(gè)細胞加入5µl（0.25µg）7-AAD染色液（7-AAD Viability Staining Solution）對死細胞染色。

14.  避光(guāng)冰上(shàng)孵育3-5min。

15.  用流式細胞儀分析結果。

【注意】：如果不能(néng)立即使用流式細胞儀分析樣品，避光(guāng)保存樣品，并且置于4-8℃保存。樣品必須重懸于細胞染色液中。注意細胞樣品不應該放(fàng)在固定緩沖液更長(cháng)時間，因其會(huì)影響熒光(guāng)素構象和熒光(guāng)信号。

實驗用産品信息：

注意事(shì)項

為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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