IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷/重組蛋白(bái)表達誘導物(wù)/啓動lacZ基因

産品關鍵詞：

IPTG異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；X-gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷；β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）；lac repressor乳糖阻遏物(wù)；lacZ Operon lacZ操縱子；Blue-white Screening藍白(bái)斑篩選；CAS NO.: 367-93-1

基本描述:

IPTG，英文全名Isopropyl-beta-D-thiogalactoside，中文全名異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，CAS NO：367-93-1，誘導細菌lac或tac操縱子調控的基因轉錄，尤其是水(shuǐ)解酶β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）。一(yī)旦表達，β-gal水(shuǐ)解β-半乳糖苷和乳糖為(wèi)單糖。IPTG通(tōng)常用于β-gal活性分析，當含大腸杆菌來源lacZ基因的載體轉染進入細胞後，編碼表達β-gal，細胞裂解後，通(tōng)過催化底物(wù)ONPG的顔色反應即可定量分析活性。IPTG也是硫代半乳糖苷轉乙酰基酶的底物(wù)，文獻報(bào)道還(hái)能(néng)誘導合成細菌青黴素酶。體内研究IPTG的一(yī)個(gè)重要優勢在于，IPTG不會(huì)大腸杆菌所代謝，IPTG濃度和lac p/o控制基因表達都保持穩定。

IPTG誘導lacZ表達的作用機(jī)制:

1）lacZ操縱子（lacZ Operon）的概念

lac操縱子是調控大腸杆菌和其他一(yī)些細菌的乳糖轉運和代謝必需的一(yī)種操縱子，包含三種緊密連接的結構基因，lacZ，lacY和lacA。包括葡萄糖和乳糖等在内的幾種因素都可調控lac操縱子。

2）IPTG誘導lacZ表達的作用機(jī)制

lacZ基因是β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）表達的一(yī)種基因。IPTG作為(wèi)一(yī)種非代謝性的半乳糖類似物(wù)，與lac repressor（lac阻遏物(wù)，乳糖阻遏物(wù)）結合，以變構形式釋放(fàng)lac操作基因（lac operator）來源的四聚體阻遏物(wù)，從(cóng)而允許lac操縱子上(shàng)的基因轉錄，比如lacZ基因表達β-gal。克隆實驗IPTG誘導lacZ基因表達。IPTG是最常用的lac操縱子合成誘導劑，在極低(dī)濃度有活性，且不會(huì)受酶降解的影響。

IPTG的主要生(shēng)理功能(néng):

1）β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）活性檢測

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）由大腸杆菌lacZ基因編碼，是最常用的一(yī)種報(bào)告酶，用來研究哺乳動物(wù)細胞的基因表達，蛋白(bái)-蛋白(bái)相(xiàng)互作用，以及标準化轉染效率。

檢測原理：IPTG誘導lacZ基因表達β-半乳糖苷酶（β-gal），細胞裂解後，體系中加入無色的ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），被β-gal水(shuǐ)解為(wèi)鄰硝基苯酚（o-nitrophenol），生(shēng)成黃色（420nm）。顔色反應的強度與β-gal活性成正比。

2）藍白(bái)斑篩選（Blue-white screening）

IPTG普遍用在需要誘導β-gal活性的克隆步驟中，最為(wèi)常見(jiàn)的就(jiù)是和X-gal聯合使用進行藍白(bái)斑克隆篩選，或與Magenta-gal聯合使用進行紅(hóng)/白(bái)斑克隆篩選。

作用機(jī)理：當目的基因插入載體lacZ基因，破壞β-gal表達并阻止其表達。細菌在含X-gal的培養基上(shàng)生(shēng)長(cháng)，β-gal水(shuǐ)解此底物(wù)生(shēng)成一(yī)不可溶藍色産物(wù)，菌落呈藍色。若β-gal不能(néng)表達，細菌克隆則無法催化X-gal底物(wù)，菌落呈白(bái)色，以此區分轉化重組載體或非重組載體的克隆子。

3）重組蛋白(bái)的誘導表達

IPTG也可用于重組蛋白(bái)的誘導表達。在這些體系中，待研究蛋白(bái)在IPTG誘導型啓動子下(xià)遊編碼。IPTG誘導待研究蛋白(bái)表達，對細胞裂解後，使用一(yī)系列合适方法來純化蛋白(bái)，如His-tag或GST-tag純化系統（融合相(xiàng)應标簽的重組蛋白(bái)）。

IPTG産品特性

1）CAS NO：367-93-1

2）英文同義名：Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; Isopropyl β-D-thiogalactoside; IPTG;

3）中文同義名：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷；

4）分子式：C9H18O5S

5）  分子量：238.30 g/mol

6）  純度：≥99%（基于幹重，HPLC）

7）  外觀：白(bái)色結晶粉末

8）  雜(zá)質：≤0.1% Dioxane（二氧六環）

9）  溶解性：溶于水(shuǐ)、乙醇

10）化學結構：

使用方法

1. IPTG儲存液配制

稱取0.238g IPTG溶于10ml去離子水(shuǐ)中，充分溶解混勻後，經0.22μm濾膜過濾除菌，即得到(dào)100mM（100×）的儲存液。按照(zhào)1ml/管分裝，置于-20℃凍存，高(gāo)達一(yī)年(nián)穩定。

2. 藍白(bái)斑篩選方法

方法1：X-Gal、IPTG加入固體培養基（推薦）

1）高(gāo)壓滅菌已加瓊脂的培養基，并冷卻到(dào)50℃左右；

2）每ml培養基内加入10μl 20mg/ml X-gal溶液、10μl 100mM IPTG（使其終濃度達到(dào)1mM）；

3）加入适量篩選抗生(shēng)素如氨苄青黴素，卡那黴素，羧苄青黴素等；

4）混勻後倒闆，置于無菌超淨台内使培養基凝固（通(tōng)常需要30min）。

5）将轉化的感受态細胞塗布到(dào)上(shàng)述平台，于37℃倒置培養過夜，觀察藍白(bái)斑情況。

方法2：X-Gal、IPTG直接塗布平闆表面

1）于無菌超淨台内幹燥倒好的平闆；

2）加120μl 20mg/ml X-gal溶液、40μl 100mM IPTG到(dào)平闆表面，并塗布均勻覆蓋整個(gè)平闆；

3）于無菌超淨台内幹燥上(shàng)述平闆，至少需要30min；

4）将轉化的感受态細胞塗布到(dào)上(shàng)述平台，于37℃倒置培養過夜，觀察藍白(bái)斑情況。

方法3：X-Gal、IPTG加入上(shàng)層培養基（噬菌體）

1）高(gāo)壓滅菌已加瓊脂（0.7%）的培養基，并冷卻到(dào)50℃左右；

2）每3ml培養基内加入40μl 20mg/ml X-gal溶液、25μl 100mM IPTG；

3）加入細菌和噬菌體混合物(wù)，翻轉離心管使快速混勻，然後倒入上(shàng)層平闆鋪平。

4）于30℃培養過夜，觀察藍白(bái)噬菌斑情況。

3. IPTG誘導重組蛋白(bái)的表達

細菌重組蛋白(bái)用IPTG誘導表達，有兩種基本方法，一(yī)種是快速誘導法，并非适合所有蛋白(bái)，且産量并非最理想。另一(yī)種是慢(màn)誘導法，能(néng)增強一(yī)些蛋白(bái)的可溶性。根據具體要求來選擇合适方法。

方法1：快速誘導法

1）從(cóng)一(yī)個(gè)相(xiàng)對新鮮平闆上(shàng)挑取一(yī)個(gè)克隆，接種到(dào)含Amp的1-2ml LB培養液，裝入15ml離心管，30°C (or 37°C)于搖床培養過夜；

2）按照(zhào)1:50（37°C培養1:100）的比例稀釋到(dào)2ml含Amp的LB培養液，裝入15ml離心管，37°C于搖床培養3-4h；

3）提前準備1ml LB+Amp+1mM IPTG，裝入15ml離心管内，并在使用前15min于37°C預熱；

4）從(cóng)步驟2中培養3-4h的培養液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上(shàng)清液。将菌體沉澱物(wù)置于-20°C待用。【此為(wèi)未誘導對照(zhào)】

5）将預熱的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到(dào)上(shàng)述培養物(wù)中，重新置于37°C培養3-4h；此時培養總體積2ml，IPTG終濃度未0.5mM。

6）從(cóng)步驟5中培養3-4h的培養液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上(shàng)清液。将菌體沉澱物(wù)置于-20°C凍存。【此為(wèi)誘導樣本】

7）SDS-PAGE檢測樣本：加入100ul 1X loading buffer（含1% BME）到(dào)未誘導和誘導樣本中。漩渦混我10s-1min，或直至看(kàn)不到(dào)細菌團。煮沸3-5min，超速離心30s。

方法2：慢(màn)速誘導法

1）—4）步驟同上(shàng)；

5）将20°C的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到(dào)上(shàng)述培養物(wù)中，重新置于20°C培養12-16h；此時培養總體積2ml，IPTG終濃度未0.5mM。

6）從(cóng)步驟5中培養12-16h的培養液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上(shàng)清液。将菌體沉澱物(wù)置于-20°C凍存。【此為(wèi)誘導樣本】

步驟3：可溶性蛋白(bái)的提取

1）用2ml冰STE（10mM Tris，pH 8.0；150mM NaCl；1mM EDTA；）洗滌細菌沉澱物(wù)一(yī)次；

2）重懸細菌沉澱物(wù)（10ml誘導培養物(wù)），用800ul含100ug/ml溶菌酶的STE；（溶菌酶必須重懸前即刻加入）；

3）冰浴15min；

4）加入DTT（貨号：MS5510-10G）使其終濃度未5mM；

5）加入蛋白(bái)酶抑制劑（貨号：MP1610-1ML）。

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注意事(shì)項

為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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