PKH26 細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜标記）

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産品關鍵詞：

PKH26；Calcein AM鈣黃綠素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking 體内細胞示蹤；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

産品信息

【好消息】：應客戶的要求，我司對試劑盒内的Diluent C可單獨供應，産品信息如下(xià)：

産品描述

PKH26細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜标記）（PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一(yī)款基于熒光(guāng)探針PKH26，用于常規細胞膜标記的檢測試劑盒，适用于體外細胞标記，體外細胞增殖以及長(cháng)期的體内細胞跟蹤研究等。

PKH26是一(yī)種專利的膜标記探針，結構上(shàng)帶有一(yī)長(cháng)脂肪族尾巴，能(néng)穩定插入細胞膜脂質區域。PKH26熒光(guāng)處于黃-橙色光(guāng)譜區間（見(jiàn)圖1），最大激發波長(cháng)為(wèi)551nm，最大發射波長(cháng)是567nm，與羅丹明或PE檢測系統兼容。也可能(néng)用标準熒光(guāng)素（Fluorescein）激發濾片，但熒光(guāng)強度可能(néng)會(huì)有些降低(dī)。PKH26具最長(cháng)的體内半衰期，超過100天，非常适用于體内細胞示蹤、細胞增殖研究和其他長(cháng)期實驗。

稀釋液C（Diluent C）是本試劑盒配套提供的一(yī)種水(shuǐ)溶性溶液，特别設計的一(yī)種标記媒介能(néng)維持細胞活力，同時最大化染料溶解性和标記過程中的染色效率。Diluent C對哺乳動物(wù)細胞來說是等滲的，不含去污劑或有機(jī)溶劑，也不含生(shēng)理鹽和緩沖劑。根據細胞類型，染料标記後膜的内在化程度，标記細胞可能(néng)呈現不同的狀态，從(cóng)明亮，到(dào)均勻點狀或斑駁狀。然而，PKH26熒光(guāng)在生(shēng)理範圍内不依賴于pH，且每個(gè)細胞的熒光(guāng)強度通(tōng)常不受染料位置的影響。

圖1. PKH26的激發和發射光(guāng)譜圖

我司（懋康生(shēng)物(wù)）提供三種規格的PKH26細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜标記），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4021-100UL）建議用于小(xiǎo)量或初步研究。當使用2ml染色體積（含2μM 終濃度的PKH26），本試劑盒含有足量的染料用于檢測25次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次），和足量的Diluent C用于5次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化确定最佳的染料濃度。

Midi Kit（CAT#：MX4021-200UL）适用于中量研究。當使用2ml染色體積（含2μM 終濃度的PKH26），本試劑盒含有足量的染料用于檢測50次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化确定最佳的染料濃度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）适用于大量或體内研究。當使用2ml染色體積（含2μM 終濃度的PKH26），本試劑盒含有足量的染料用于檢測125次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化确定最佳的染料濃度

産品包裝

保存與運輸方法

保存：2-8ºC避光(guāng)保存，1年(nián)有效。其中組分A（PKH26 Dye）需嚴格避光(guāng)，蓋子保持擰緊。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）   PKH26是以溶于乙醇的儲存液形式提供，保存的過程中需避光(guāng)并擰緊蓋子，以防止溶液揮發引起的染料濃度提高(gāo)。使用前需檢查是否有結晶，若有結晶，需在37℃水(shuǐ)浴溶晶，超聲或渦旋直至完全溶解。

2）   Diluent C使用前需置于室溫回溫之後再配制标記用的細胞和染料工(gōng)作液。Diluent C是無菌溶液，不含任何防腐劑或抗生(shēng)素，使用和保存過程中都注意無菌。

3）   PKH26不能(néng)保存在Diluent C内，保存在Diluent C的染色工(gōng)作液需在使用前配制，現配現用。

4）   熒光(guāng)染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光(guāng)，以減緩熒光(guāng)淬滅。

5）   為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

操作步驟

一(yī)、 自(zì)行準備儀器(qì)和試劑（試劑盒不提供，用于常規細胞膜标記）

﹒良好分散，均勻的單細胞懸液（懸浮于組織培養基）

﹒含血清的組織培養基（完全培養基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培養基，或生(shēng)理鹽溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白(bái)蛋白(bái)或其他系統兼容的蛋白(bái)

﹒聚丙烯錐底離心管（4-15ml）

﹒能(néng)控溫的離心機(jī)（高(gāo)達1000×g）

﹒熒光(guāng)分析用儀器(qì)（熒光(guāng)酶标闆，熒光(guāng)或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）

﹒無菌層流淨化罩

﹒血球計數闆或自(zì)動細胞計數裝置

﹒載玻片和蓋玻片

二、 常規細胞膜标記

【注意事(shì)項】：

1）   通(tōng)過分配脂質染料進入細胞膜來進行标記。标記強度是染料濃度和細胞濃度共同作用的一(yī)種功能(néng)，且不會(huì)飽和。因此，用來标記的染料濃度需要有限，過度标記細胞會(huì)引起細胞膜完整性喪失和降低(dī)的細胞複原能(néng)力。

2）   以下(xià)步驟适用于體外或離體标記幹細胞、淋巴細胞、單個(gè)核細胞、内皮細胞、神經元或任何需要将染料插入細胞膜脂質區的其他細胞類型。而體内标記、血小(xiǎo)闆标記，或在含非吞噬細胞的群體内選擇性标記吞噬細胞，需對步驟做适當修改。

3）   需在單克隆抗體染色前進行常規細胞膜染色。4℃單克隆抗體染色過程中膜染料仍能(néng)維持穩定。然而，如果單抗标記後再室溫下(xià)進行常規細胞膜染色，極有可能(néng)引起單抗的“蓋帽”發生(shēng)。

4）   以下(xià)步驟中用到(dào)的細胞和染料濃度是推薦用的起始濃度，廣譜适用于各種細胞類型。用戶需根據自(zì)身細胞類型和實驗目的确定最佳的染料和細胞濃度，通(tōng)過對染色後細胞活力（比如碘化丙啶排斥），熒光(guāng)強度，染色均勻性和對待研究細胞功能(néng)無影響等方面來綜合評估。

5）   PKH26染色過程中需避免疊氮化物(wù)或代謝毒物(wù)的存在。

6）   雖然粘附在固相(xiàng)基質上(shàng)的貼壁細胞可能(néng)被标記，使用單細胞懸浮液能(néng)得到(dào)更勻質的染色結果。染色前使用蛋白(bái)消化酶比如胰酶/EDTA處理貼壁或結合細胞制備成分散的單細胞懸液能(néng)得到(dào)最好的染色結果。

【染色流程】：

以下(xià)操作流程使用2ml最終染色體積，含2μM PKH26，以及1×107個(gè)細胞/ml。

以下(xià)所有步驟都在室溫下(xià)進行（20-25℃）。

1.1    取一(yī)錐底聚丙烯離心管制備2×107個(gè)細胞的單細胞懸浮液，用無血清培養基清洗細胞一(yī)次。

【注意】：血清蛋白(bái)和脂質也會(huì)結合染料，降低(dī)用于膜标記的有效染料濃度。用無血清培養基或緩沖液（Step 1.1）清洗細胞一(yī)次，然後再用Diluent C重懸細胞用于标記能(néng)得到(dào)最佳結果。

1.2    400×g離心細胞5min，得到(dào)松散的細胞沉澱。【注意】：PKH26乙醇儲存液不能(néng)直接加入細胞沉澱上(shàng)，否則會(huì)引起異質染色和降低(dī)的細胞活力。

1.3    細胞離心後，輕輕吸掉上(shàng)清。注意不要移動任何細胞并且殘留不超過25μl上(shàng)清液。

【注意】：為(wèi)了得到(dào)重複性結果，最小(xiǎo)化殘留培養基或緩沖液很重要，然後再将細胞重懸在Diluent C中。

1.4    加1ml Diluent C到(dào)細胞沉澱中制備成2×細胞懸液，用槍輕輕吹勻以确保完全分散。不可渦旋和不可讓細胞長(cháng)期保留在Diluent C中。

【注意】：生(shēng)理鹽離子的存在導緻染料形成膠團，實質上(shàng)降低(dī)染色效率。因此，染料添加的時候細胞懸浮在Diluent C中很重要，而不是在培養基或緩沖鹽溶液中。

1.5   染色前立即制備2×染色液（4μM in Diluent C）：通(tōng)過将4μl PKH26乙醇儲存液到(dào)1ml Diluent C中，充分混勻分散所得。

【注意】：

a）為(wèi)了最小(xiǎo)化乙醇對細胞活力影響，Step 1.5中加入的染料體積産生(shēng)占Step 1.6中不超過1-2%的乙醇量；b）若想得到(dào)＜2μM的最終染料濃度，用未變性的100%無水(shuǐ)乙醇稀釋試劑盒提供的PKH26乙醇儲存液到(dào)一(yī)中間染料濃度，能(néng)得到(dào)最好的重複染色結果。

1.6   快速加1ml 2×細胞懸液（Step 1.4）到(dào)1ml 2×染色液（Step 1.5），用槍立即混勻樣本。混勻後樣本得到(dào)的終濃度是1×107個(gè)細胞/ml 和2μM PKH26。

【注意】：由于染色幾乎是一(yī)瞬間發生(shēng)，在染色工(gōng)作液中快速且均勻分散細胞對得到(dào)明亮、一(yī)緻和重複的标記結果至關重要。以下(xià)措施都有利于得到(dào)優化結果：

a.       不要将PKH26乙醇儲存液直接加到(dào)2×染色液（4μM in Diluent C）中。

b.       混勻等體積的2×細胞懸液（Step 1.4）和2×染色液（Step 1.5）。

c.       調整2×細胞懸液和2×染色液體積，避免在很小(xiǎo)（＜100μl）或很大（＞5ml）體積。

d.       使用自(zì)動移液器(qì)或相(xiàng)同産品用于快速添加細胞和與染料混勻。血清學移液管很慢(màn)，得到(dào)相(xiàng)對更不一(yī)緻的染色。“推壓”或渦旋也很慢(màn)，得到(dào)相(xiàng)對更不一(yī)緻染色。

e.       盡可能(néng)精确加量體積，為(wèi)了精确重複每個(gè)樣品間和每個(gè)研究間用到(dào)的細胞和染料濃度。

1.7    Step 1.6中的細胞/染料懸液孵育1-5min，中間定期混合。染色過程非常快，更長(cháng)時間無任何益處。

【注意】：以獲得理想染色結果的最短時間進行細胞孵育。由于Diluent C不含生(shēng)理鹽，更長(cháng)的細胞孵育可能(néng)引起某些細胞類型活力降低(dī)。如果猜測可能(néng)有此效應産生(shēng)，那麽同時設置一(yī)個(gè)僅含Diluent的對照(zhào)和一(yī)個(gè)使用乙醇染色而不是染料染色的陰性對照(zhào)（mock-stained control）。

1.8    加入等體積（2ml）血清或其他适當蛋白(bái)溶液（比如1% BSA），孵育1min允許結合多(duō)餘的探針。

【注意】：

a.血清（或等蛋白(bái)濃度溶液）更适合用作終止液。如果用完全培養基直接替代血清提高(gāo)加入體積到(dào)10ml。

b. 在終止染色反應前不要通(tōng)過加入Diluent C或離心細胞到(dào)Diluent C來終止。

c.不要使用無血清培養基或生(shēng)理鹽溶液，會(huì)引起細胞相(xiàng)關染料聚合物(wù)産生(shēng)。染料聚合物(wù)好比未結合染料的“緩釋水(shuǐ)池”，通(tōng)過清洗不能(néng)有效去除，且會(huì)轉移到(dào)實驗體系中的未标記細胞上(shàng)。

1.9    20-25℃，400×g離心細胞10min，輕輕吸掉上(shàng)清，确保不會(huì)移動細胞。用10ml完全培養基重懸細胞，轉移到(dào)一(yī)個(gè)幹淨無菌的錐底聚丙烯離心管中，20-25℃，400×g離心細胞5min。然後用10ml完全培養基清洗細胞沉澱＞2次，以确保完全去除未結合染料。

【注意】：轉移到(dào)一(yī)幹淨離心管内能(néng)增加清洗效率，通(tōng)過最小(xiǎo)化結合到(dào)管壁上(shàng)的殘留染料的交叉污染；不要使用Diluent C用于清洗。

1.10  最後一(yī)步清洗後，用10ml完全培養基重懸細胞沉澱，用來評估細胞回收，細胞活力和染色強度。離心和重懸沉澱到(dào)一(yī)理想終濃度的活細胞懸液。

【注意】：

a.       染色細胞可能(néng)用1-2%中性緩沖甲醛固定，若樣本避光(guāng)保存熒光(guāng)強度可穩定保存至少3周。

b.       染色通(tōng)常比背景自(zì)熒光(guāng)至少強100-1000倍。熒光(guāng)分布必須勻稱，且盡量均質，雖然染色CV取決于染色細胞類型。

PKH26客戶使用案例（逐步增加中。。。。。。）

 圖片描述：巨噬細胞（106個(gè)/mL）經PKH26（MKBio, 貨号：MX4021-100UL，使用濃度：4uL/mL，5min）标記，熒光(guāng)顯微鏡（Ex/Em=551nm/567nm）檢測。【數據來源：華東理工(gōng)大學藥學院 李老師(shī)】

圖片描述：斑馬魚體内給PKH26（MKBio，貨号：MX4021-100UL）标記以及熒光(guāng)成像。【數據來源：蘭州大學醫(yī)學院 潘老師(shī) 】

相(xiàng)關産品

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海夢澤生物科技有限公司是一(yī)家涉足于生(shēng)命科學和生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域研究的試劑、儀器(qì)和實驗室消耗品與實驗服務工(gōng)作，主要從(cóng)事(shì)細胞生(shēng)物(wù)學、植物(wù)學、分子生(shēng)物(wù)學、免疫學、生(shēng)物(wù)化學、蛋白(bái)組學。生(shēng)物(wù)制藥與診斷試劑研發生(shēng)産等領域。 本公司秉承“以人為(wèi)本，以誠為(wèi)信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為(wèi)廣大客戶提供優質産品。

延伸閱讀(dú)（懋康生(shēng)物(wù)獨家整理）

鑒于近期大量的用戶咨詢PKH26用于外泌體染色（exosome stain）的方法，我司查閱相(xiàng)關文獻資料，提供染色相(xiàng)關的一(yī)些信息，僅供交流學習用。

摘自(zì)文獻1）Pužar Dominkuš P et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2018 Jun;1860(6):1350-1361. PMID: 29551275

◇◇ 外泌體染色（Exosome staining）(簡單流程見(jiàn)Fig 1)

外泌體凍幹标準用超純水(shuǐ)重懸制備成1.0μg/μL溶液，之後用PKH26紅(hóng)色熒光(guāng)檢測試劑盒來标記。染色前，溶于Diluent C的PKH26在超純水(shuǐ)水(shuǐ)浴鍋于37℃孵育15min。對于對照(zhào)樣品，用不含顆粒的DPBS來替代外泌體标準。

① 染色流程A

PKH26用100μL diluent C稀釋使其終濃度為(wèi)8μM（染料濃度）。之後10μg外泌體（in 20μL DPBS，MKBio）用80μL diluent C稀釋，加入染料溶液内，孵育5min，同時用槍輕輕混勻。用100μL不含外泌體的10% FBS (in DMEM，MKBio)來結合多(duō)餘的染料。之後，外泌體用1ml DPBS稀釋，4°C超速（100000×g）離心1h 10min。之後沉澱用50μL DPBS輕輕重懸。

② 染色流程B

外泌體的染色方法同流程A。之後稀釋到(dào)2ml DPBS，轉移到(dào)Vivaspin20 300-kDa MWCO filters，于4°C（4000×g）離心3min，之後用2ml DPBS清洗3次，最終用沉澱用50μL DPBS輕輕重懸。

③ 染色流程C

外泌體的染色方法同流程A。之後稀釋到(dào)10ml DPBS，置于2ml 20%蔗糖（in DPBS，，MKBio）的上(shàng)層。外泌體用4°C超速（100000×g）離心1h 10min。之後沉澱用50μL DPBS輕輕重懸。

④ 染色流程D

外泌體的染色方法同流程A。之後稀釋到(dào)400μL DPBS，置于20%~60%非連續蔗糖梯度（in DPBS）的上(shàng)層。外泌體用4°C超速（100000×g，MKBio）離心18h。分層3-6（密度範圍1.08–1.15g/mL）吸在一(yī)起，分層7-10（密度範圍1.17–1.23g/mL）吸在一(yī)起，每一(yī)份都稀釋到(dào)30ml DPBS。外泌體用4°C超速（100000×g）離心1h 10min。之後沉澱用50μL DPBS輕輕重懸。

Fig. 1. Schematic representation of staining procedures used to label exosomes with PKH26 dye. Exosomes (exo) were labeled using staining procedures based on ultracentrifugation (procedure A), filtration through Vivaspin concentrators (procedure B), and sucrose cushion (procedure C) and sucrose gradient (procedure D) purification. Key differences between the procedures are highlighted by the green text.

◇◇ 外泌體檢測（Confocal microscopy）

取小(xiǎo)體積（6μL）輕輕混勻的PKH26标記對照(zhào)和外泌體樣本分别轉移到(dào)包被有10%多(duō)聚L-賴氨酸的蓋玻片上(shàng)，然後封固在載玻片上(shàng)，然後轉移到(dào)共聚焦顯微鏡下(xià)觀察。用561nm diode-pumped solid state laser line觀察，用565nm-605nm寬帶濾片來檢測發射光(guāng)。

◇◇ 外泌體染色結果分析

針對幾種染色流程，發現①超速離心為(wèi)基礎的外泌體染色會(huì)産生(shēng)大量的PKH26納米粒子（nanoparticles），直徑類似于PKH26标記的外泌體。②基于過濾（filtration）為(wèi)基礎的外泌體染色法典型的特征是PKH26标記顆粒的回收率低(dī)。③通(tōng)過蔗糖緩沖層純化的PKH26标記納米粒子和PKH26标記外泌體根據大小(xiǎo)能(néng)區分開(kāi)。④PKH26标記納米粒子和PKH26标記外泌體通(tōng)過進入濃縮蔗糖梯度層能(néng)分開(kāi)。

摘自(zì)資料2）來自(zì)網絡資源。

PKH染料（常用的有PKH26-MX4021和PKH67）大量文獻用來标記外泌體和胞外囊泡進行體外和體内示蹤實驗。以下(xià)步驟可參考用于外泌體标記以進行微囊泡示蹤實驗。

外泌體标記步驟：

（1）利用超速或微過濾的方式制備新鮮的外泌體沉澱。

（2）超速離心機(jī)冷卻到(dào)2-8℃。将每個(gè)樣本的多(duō)管離心沉澱聚合在一(yī)起，之後測定總體積。

（3）用Diluent C, MX4022将所有體積的沉澱稀釋到(dào)高(gāo)達1ml。

（4）确定最大體積的沉澱樣本，加等體積的不含外泌體的培養基到(dào)一(yī)個(gè)新管内，用Diluent C稀釋到(dào)1ml。

（5）加6μLPKH26到(dào)1ml Diluent C管内（步驟3和步驟4）。

（6）用槍連續性輕輕混勻30s。室溫靜(jìng)置5min。

（7）加入含2ml 10% BSA（in PBS）來淬滅反應。用無血清培養基定容體積到(dào)8.5ml。

（8）制備0.971M的蔗糖溶液。用槍緩慢(màn)吸取1.5ml蔗糖溶液，加到(dào)管子底部，确保不會(huì)産生(shēng)震蕩。外泌體-PKH26 MX4021标記溶液加在蔗糖緩沖層（sucrose cushion）的上(shàng)方。

（9）于2-8℃超速（190,000 G）離心2h。「注意：外泌體在沉澱内，絕大部分多(duō)餘的染料在中間層」。小(xiǎo)心吸取培養基和中間層。

（10）輕輕用槍将外泌體沉澱重懸在1X PBS。

（11）轉移到(dào)Amicon 10kDa MWCO超濾管内。加9ml PBS，0.75ml培養基。

（12）于3000 x g離心40min，使得最終保留體積在0.5-1mL。

（13）從(cóng)Amicon超濾管内吸取濃縮液，保存在冰上(shàng)。盡快于合适的儀器(qì)下(xià)分析熒光(guāng)信号。

引用文獻：

[1]

Yu Mengyu et al. Targeted exosome‐encapsulated erastin induced ferroptosis in triple negative breast cancer cells. Cancer Science. 2019;110:3173–3182.

Targeted exosome‐encapsulated erastin induced ferroptosis in triple negative breast cancer cells.

To quantify the amount of erastin@FA‐exo and erastin@exo taken up by MDA‐MB‐231 cells, lipophilic fluorescent dye PKH26 (MaoKang Biotechnology) was used to stain the exosomes. To detect the effect of FA receptor binding on cell uptake, culture medium containing 1.1 mg/mL of free FA was added to MDA‐MB‐231 cells to competitively inhibit FA receptors. After incubation for 6 hours, the cells were washed with PBS 3 times.Then erastin@FA‐exo was added and the cells’ uptake of the drug was observed.

[2]

Yanlin Wang et al. Microfluidic Raman biochip detection of exosomes: a promising tool for prostate cancer diagnosis. Lab Chip, 2020,20, 4632-4637 https://doi.org/10.1039/D0LC00677G

PKH26 was obtained from Maokangbio Co., Ltd (Shanghai, China).

【3】Wu B, Ye Y, Xie S, Li Y, Sun X, Lv M, Yang L, Cui N, Chen Q, Jensen LD, Cui D, Huang G, Zuo J, Zhang S, Liu W, Yang Y. Megakaryocytes Mediate Hyperglycemia-Induced Tumor Metastasis. Cancer Res. 2021 Nov 1;81(21):5506-5522. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-21-1180. Epub 2021 Sep 17. PMID: 34535458.

For the platelets adhesion assay, the platelet cell membrane was prelabeled by a PKH26 Cell Linker Kit (catalog no. MX4021, Maokangbio) for visualization.