Calcein AM/PI Double Stain Kit 活細胞/死細胞雙染試劑盒

産品關鍵詞：

Calcein, AM 鈣黃綠素AM；Calcein Red 鈣黃綠素紅(hóng)；活細胞染色探針；Fluorescein diacetate (FDA)；Propidium Iodide (PI) 碘化丙啶；CAS NO：148504-34-1；

産品信息

【溫馨提示】：見(jiàn)我司懋康生(shēng)物(wù)（maokangbio）整理的鈣黃綠素（Calcein）系列産品專題。

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産品描述

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一(yī)種具細胞膜滲透性的活細胞熒光(guāng)染料，呈綠色熒光(guāng)（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團的存在不僅加強疏水(shuǐ)性，使其能(néng)輕易穿透活細胞膜。而且封閉結合鈣離子的分子部分，本身不發熒光(guāng)。一(yī)旦進入細胞後，被細胞内酯酶水(shuǐ)解為(wèi)鈣黃綠素（calcein），能(néng)與胞内鈣離子結合，産生(shēng)強烈的綠色熒光(guāng)。因不具有細胞膜滲透性，從(cóng)而被保留在胞内。與其它活細胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相(xiàng)比，Calcein, AM最适合用于活細胞染色探針，因細胞毒性很低(dī)，而且不會(huì)抑制任何細胞功能(néng)如增殖或淋巴細胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實驗結果十分可信，與标準的51Cr釋放(fàng)法所得結果一(yī)緻。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對活細胞進行标記，這一(yī)特征使其非常适合用來檢測細胞活力和細胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯合使用，因其僅能(néng)穿過死細胞膜的無序區域到(dào)達細胞核，嵌入細胞的DNA雙螺旋區域，并産生(shēng)紅(hóng)色熒光(guāng)（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光(guāng)顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。用545 nm激發，僅可觀察到(dào)死細胞。結合這些特點，Calcein, AM和PI經常被結合用作活細胞和死細胞的雙重染色。

本試劑盒就(jiù)是結合Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色标記，從(cóng)而進行活細胞和死細胞水(shuǐ)平的分析。根據試劑盒優化體系，單次以200µl細胞懸液進行染色，分别可做500次（貨号：MX3012-500T）和1000次（貨号：MX3012-1000T）檢測。

試劑盒組分

保存與運輸方法

保存：-20℃避光(guāng)保存，有效期一(yī)年(nián)。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量後，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工(gōng)作液必須現配現用。

2）碘化丙啶（PI）有一(yī)定的緻癌性，操作時一(yī)定要注意防護。若接觸到(dào)皮膚，需要立即用自(zì)來水(shuǐ)清洗。

3）為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

一(yī)、試劑準備

1.1 1×反應緩沖液（Assay Buffer）的配制

從(cóng)低(dī)溫冰箱内取出10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件(jiàn)取出适量，用去離子水(shuǐ)（dH2O）做10倍稀釋以得到(dào)1×Assay Buffer。

1.2   1×染色工(gōng)作液（Stain Buffer）的配制

1）   先将低(dī)溫保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室溫回溫至少20min，使其充分融化。【注意：第一(yī)次使用時建議對儲存液根據單次用量分裝，特别是Calcein AM，以減少反複凍融次數。】

2）   取5µl Calcein AM溶液 (4 mM)和15µl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到(dào)Calcein AM的工(gōng)作液濃度為(wèi)4μM，PI的工(gōng)作液濃度為(wèi)4.5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件(jiàn)不同，初次實驗建議做梯度實驗，以确定 Calcein-AM和PI的最适濃度。梯度篩選的原則為(wèi)使用最低(dī)的探針濃度得到(dào)最好的熒光(guāng)結果。【注意：染色工(gōng)作液必須現配現用，并且在當天用完。】

二、染色步驟

2.1  對于貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，之後離心收集細胞（1000 rpm，3min）。

對于懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細胞。

2.2  去上(shàng)清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3  用1×Assay Buffer制備細胞懸液，使其密度為(wèi)1×105~1×106細胞/ml。

2.4  取100µl染色工(gōng)作液加入200µl細胞懸液内，混勻，37℃孵育15min。

【注意：如果需要，可延長(cháng)孵育時間至30min。】

2.5  熒光(guāng)顯微鏡下(xià)使用490±10 nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光(guāng)）以及死細胞（紅(hóng)色熒光(guāng)）。另外，使用545nm的發射濾片僅能(néng)觀察到(dào)死細胞。也可以直接在熒光(guāng)酶标儀下(xià)使用合适的濾片進行檢測。

【注意】：可以使用以下(xià)方法來優化得到(dào)兩種熒光(guāng)染料的最佳工(gōng)作濃度。

a)  用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高(gāo)辛孵育細胞10min，或者用70%乙醇孵育細胞30min，從(cóng)而制備死細胞；

b)  用0.1-10µM的PI溶液進行死細胞染色，以得到(dào)僅僅對細胞核染色，而不會(huì)對細胞質染色的最佳工(gōng)作濃度。

c)  用0.1-10µM的Calcein AM進行死細胞染色，以得到(dào)不會(huì)對細胞質染色的最佳工(gōng)作濃度。然後用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能(néng)被染色。

測定方法與結果呈現

1）  熒光(guāng)顯微鏡（Fluorescent Microscopy）

檢測方法：490±10 nm激發能(néng)同時看(kàn)到(dào)呈黃-綠色熒光(guāng)的活細胞和紅(hóng)色的死細胞。另，545nm激發可能(néng)隻能(néng)看(kàn)到(dào)呈紅(hóng)色的死細胞。

Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2） 熒光(guāng)酶标儀（Fluorescent Plate Reader）

檢測方法：96孔透明底的黑(hēi)色酶标闆（96-well black plate with clear bottom），Calcein檢測的激發波長(cháng)為(wèi)490nm，發射波長(cháng)為(wèi)520nm；PI檢測的激發波長(cháng)為(wèi)530nm，發射波長(cháng)為(wèi)617nm；

3） 流式細胞儀（Flow cytometer）

檢測方法：流式細胞儀，Calcein檢測的激發/發射波長(cháng)為(wèi)488/535nm，PI的激發和發射波長(cháng)為(wèi)488/620nm。

Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

常見(jiàn)問題

1、  該試劑盒适用任何細胞類型？

基本上(shàng)适用于任何含酯酶活性的動物(wù)細胞。植物(wù)和細菌細胞因含有細胞壁，Calcein-AM不能(néng)進入因此無法染色。有可能(néng)對原生(shēng)質體進行染色。

2、  用相(xiàng)同濃度有可能(néng)對所有哺乳動物(wù)細胞進行染色？

對所有細胞都用相(xiàng)同的濃度是很不合理的。Calcein-AM和PI的最佳工(gōng)作濃度根據細胞類型差異很大。有必要根據具體細胞來确定最佳染料濃度。參考說明書染料工(gōng)作濃度優化方法。

3、  Calcein-AM對細胞有毒？

與其他相(xiàng)似的活細胞染料比較，Calcein-AM基本無毒（毒性最小(xiǎo)）。見(jiàn)文獻EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)

相(xiàng)關産品

— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海夢澤生物科技有限公司是一(yī)家涉足于生(shēng)命科學和生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域研究的試劑、儀器(qì)和實驗室消耗品與實驗服務工(gōng)作，主要從(cóng)事(shì)細胞生(shēng)物(wù)學、植物(wù)學、分子生(shēng)物(wù)學、免疫學、生(shēng)物(wù)化學、蛋白(bái)組學。生(shēng)物(wù)制藥與診斷試劑研發生(shēng)産等領域。 本公司秉承“以人為(wèi)本，以誠為(wèi)信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為(wèi)廣大客戶提供優質産品。

文獻引用：

[1]

Zhang XX et al. Characterization and property of dual-functional Zn-incorporated TiO2 micro-arc oxidation coatings: The influence of current density. Journal of Alloys and Compounds Volume 810, 25 November 2019, 151893

After the formazan was dissolved by dimethyl sulfoxide (DMSO), the optical density (OD) was then determined using enzyme-labeled instrument (iMark, BIO-RAD, US) at the wavelength of 570 nm. To reveal the viability of adherent MC3T3-E1 cells, a Live/Dead Double Staining Kit (MKBio, China).was employed. After 1 day culture, ... stained with Calcein acetoxymethyl ester (Calcein AM) and propidium.

[2]

Zheying Meng et al. Marriage of Virus-Mimic Surface Topology and Microbubble-Assisted Ultrasound for Enhanced Intratumor Accumulation and Improved Cancer Theranostics.

Calcein-AM and PI were purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).

[3]

Xijian Liu et al. Facile synthesis of biocompatible cysteine-coated CuS nanoparticles with high photothermal conversion efficiency for cancer therapy. Dalton Trans., 2014,43, 11709-11715

Calcein AM/propidium iodide (PI) double stain kit, propidium iodide(PI), and fluorescein isothiocyanate (FITC) were purchased from Shanghai Maokang