Alkaline Phosphatase Assay Kit (Colorimetric) 堿性磷酸酶檢測試劑盒（顯色法）

産品标簽：

Phosphatase, Alkaline堿性磷酸酶；ALP/AKP；對硝基苯酚磷酸鹽（pNPP）；偶氮偶聯法；顯色法（定量）；染色法（定性）；

産品信息

【溫馨提示I】：見(jiàn)堿性磷酸酶産品專題，了解更多(duō)相(xiàng)關産品資料；

【溫馨提示II】：見(jiàn)堿性磷酸酶染色試劑盒産品；

【溫馨提示III】：見(jiàn)堿性磷酸酶活性檢測試劑盒産品專題；

【溫馨提示IV】：見(jiàn)堿性磷酸酶常用生(shēng)化底物(wù)及試劑盒産品；

産品描述

堿性磷酸酶（ALP）活性的變化與一(yī)系列生(shēng)理和病理事(shì)件(jiàn)緊密關聯，比如骨骼發育、骨骼相(xiàng)關疾病、妊娠相(xiàng)關疾病和炎症性腸病（inflammatory bowel diseases）等。正因如此，ALP被用作衡量生(shēng)理特征或疾病的參照(zhào)指标。另外，ALP活性檢測在環境監測、食品質量控制等方面也呈現重要作用。如，幹細胞如誘導多(duō)潛能(néng)幹細胞iPS，ALP活性很高(gāo)，則ALP常被用作iPS誘導成功的标志(zhì)；分化的結腸癌細胞内ALP活性顯著提高(gāo)，則ALP常被當做結腸癌細胞分化程度的指标（定性/定量）；血清中ALP水(shuǐ)平提高(gāo)，被稱作高(gāo)堿性磷酸酶血症，此症狀被認為(wèi)和惡性膽管阻塞、原發性膽管硬化、原發性硬化膽管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝膽疾病密切相(xiàng)關；ALP是成骨細胞的副産物(wù)，血清中ALP活性升高(gāo)和骨頭發育密切關聯；

本試劑盒能(néng)對細胞或組織裂解液或勻漿液、血清、血漿、尿液等樣品内源性堿性磷酸酶活性進行檢測。原理在于：對硝基苯酚磷酸鹽（pNPP）是一(yī)種常用的堿性磷酸酶（ALP）顯色底物(wù)，堿性條件(jiàn)下(xià)能(néng)被ALP催化生(shēng)成對硝基酚（para-nitrophenol，p-nitrophenol），呈黃色産物(wù)，可在400-415nm檢測到(dào)吸光(guāng)度。産物(wù)黃色越深，代表ALP活性越高(gāo)，反之則酶活性越低(dī)。則通(tōng)過比色分析可定量檢測ALP水(shuǐ)平。

本試劑盒可檢測100個(gè)樣品，包括标準品和空白(bái)對照(zhào)。

産品組成

保存與運輸方法

保存：-20℃凍存，1年(nián)穩定。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1. 若希望進行酶活力的絕對定量，進行酶反應時必須注意精确計時。此時推薦孵育30min等較長(cháng)時間，以減小(xiǎo)操作過程中的時間誤差。若樣品中酶活性較高(gāo)，則可預先适當稀釋樣品。

2. 樣品溶液中須避免出現EDTA、氟離子、檸檬酸鹽等堿性磷酸酶抑制劑。

3. 檢測緩沖液和對硝基苯酚标準品對人體有害，請注意适當防護。反應終止液有腐蝕性，請小(xiǎo)心操作。

4. 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

操作步驟

1. 試劑準備：将所有試劑取出，恢複至室溫待用。

a) 顯色底物(wù)溶液：取一(yī)管顯色底物(wù)，溶解于2.5ml的檢測緩沖液中，充分溶解和混勻，冰上(shàng)放(fàng)置。新鮮配制的顯色底物(wù)溶液需在數小(xiǎo)時（≤ 6h）内使用。

b) 标準品工(gōng)作液：取10μl 對硝基苯酚标準品（10mM），用檢測緩沖液稀釋至200μl ，使得終濃度為(wèi)0.5mM。

2. 樣品準備

a) 細胞或組織裂解液的準備：采用适當細胞或組織裂解液裂解細胞和組織，如有必要需進行适當勻漿，随後離心取上(shàng)清，用于ALP活性檢測。【注意】：裂解液中不能(néng)含磷酸酶抑制劑。樣品可-80℃凍存，避免反複凍融。

b) 血漿、血清和尿液的準備：血漿和血清按照(zhào)常規方法制備後可以直接用于本試劑盒的測定，但為(wèi)了消除樣品本身顔色的幹擾，需設置加了血漿或血清但不加底物(wù)的對照(zhào)。【注意】：血漿制備不能(néng)用含EDTA和檸檬酸鹽的抗凝管。尿液通(tōng)常也可直接用于測定。上(shàng)述樣品可-80℃凍存，避免反複凍融。

c) 樣品的稀釋：若樣品中含有較高(gāo)的ALP活性，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，也可以用試劑盒中的檢測緩沖液進行稀釋。若使用試劑盒内的檢測緩沖液進行稀釋，需注意保留足夠的緩沖液用于該試劑盒的檢測過程。

3．加樣

參考下(xià)表使用96孔闆設置空白(bái)對照(zhào)孔、标準品孔和樣品孔。标準品的用量分别為(wèi)4、8、16、24、32和 40μl，樣品通(tōng)常可以直接加50μl。如果樣品中的ALP活性過高(gāo)，可以減少樣品用量或适當稀釋後再進行測定。

4. 混勻：用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進行混勻。
5. 孵育：37℃孵育5-10min。（若待測樣品中ALP活性較低(dī)時，可适當延長(cháng)孵育時間至30min）

6. 終止：每孔加入100μl反應終止液終止反應。此時，标準品或有ALP活性的孔會(huì)呈現不同深淺的黃色。

7. 檢測：405nm處測定吸光(guāng)度。如果不能(néng)測定405nm，也可以在400-415nm範圍内檢測吸光(guāng)度。如果不能(néng)立即測定，可以在數小(xiǎo)時内完成測定，所顯現的黃色在數小(xiǎo)時内穩定。

8. 單位定義：

堿性磷酸酶活性單位的定義：在pH9.8的二乙醇胺（DEA）緩沖液中，37℃條件(jiàn)下(xià)，每min水(shuǐ)解pNPP顯色底物(wù)産生(shēng)1μM對硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定義為(wèi)一(yī)個(gè)酶活力單位，也被稱作一(yī)個(gè)DEA酶活力單位。在pH9.6的甘氨酸緩沖液中，25℃條件(jiàn)下(xià)，每min水(shuǐ)解pNPP顯色底物(wù)産生(shēng)1μM對硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定義為(wèi)一(yī)個(gè)酶活力單位，也被稱作一(yī)個(gè)甘氨酸酶活力單位。一(yī)個(gè)甘氨酸酶活力單位約相(xiàng)當于3個(gè)DEA酶活力單位。本試劑盒測定的是DEA酶活力單位。

9. 結果分析：根據酶活性單位的定義，計算(suàn)出樣品中的堿性磷酸酶活性。 

常見(jiàn)問題

1.   說明書提及配制好的顯色底物(wù)溶液需在6小(xiǎo)時内使用完。試劑盒隻提供了兩管顯色底物(wù)，是不是意味

著(zhe)隻能(néng)做兩次？

回答：是的。顯色底物(wù)以粉末形式提供，單次實驗需取一(yī)管全部配成顯色底物(wù)溶液，且需要在6小(xiǎo)時内用完，不建議凍存後再使用。為(wèi)了避免試劑盒浪費(fèi)，請在累積足夠的樣本後再進行檢測。

2.   本試劑盒适用于細胞培養上(shàng)清内堿性磷酸酶的檢測嗎(ma)？

回答：不可以。本試劑盒常用于細胞裂解液的檢測，不适合細胞培養上(shàng)清的檢測，因為(wèi)上(shàng)清内的酶量偏低(dī)，不足以被本試劑盒檢測到(dào)，無法反映真實結果。

3.   本試劑盒内提及合适的細胞和組織裂解液，有沒有推薦的？

回答：推薦使用我司的免疫印迹及免疫沉澱用裂解液（不含蛋白(bái)酶/磷酸酶抑制劑）（Cat#: MP1508-100ML）。或自(zì)行配制含0.2% Triton X-100的PBS，TBS或生(shēng)理鹽水(shuǐ)等适當溶液。裂解液内不能(néng)含任何磷酸酶抑制劑。

4.   本試劑盒内的堿性磷酸酶活性如何計算(suàn)所得？

回答：根據标準曲線和待測樣品的吸光(guāng)值，可計算(suàn)到(dào)樣品中對硝基苯酚（p-Nitrophenol）生(shēng)成量。再根據酶活性定義：将生(shēng)成的對硝基苯酚摩爾量除以孵育時間，進行酶活計算(suàn)。制作标準曲線時，可以将橫坐标體積轉換算(suàn)成摩爾數，再繪制标準曲線，方便後續計算(suàn)。根據标準曲線方程計算(suàn)出生(shēng)成的對硝基苯酚摩爾量除以37℃孵育的時間即得到(dào)酶活。

相(xiàng)關産品

文獻引用：

Wang CH et al. Colorimetric logic gate for alkaline phosphatase based on copper (II)-based metal-organic frameworks with peroxidase-like activity. Analytica Chimica Acta Volume 1004, 3 April 2018, Pages 74-81

Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit using p-nitrophenyl phosphate (pNPP) as aphosphatase substrate was purchased from MKbio Co. Ltd. (Shanghai, China).