Fluo-8, AM, Cell Permeant鈣離子熒光(guāng)探針，超級純

（最亮的可見(jiàn)光(guāng)鈣離子探針）

【務必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（MS4301-1G）一(yī)起使用，以提高(gāo)探針的水(shuǐ)溶性和胞内加載性。 

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搜索關鍵詞：

Fluo-8 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光(guāng)探針；Fluo-2, AM；Fluo-2 Medium Affinity,Acetoxymethyl Ester；Fluo-3；Fluo-4；HTS Screen Assay 高(gāo)通(tōng)量篩選；

訂購信息：

産品描述

Fluo-8，是目前最亮的可見(jiàn)光(guāng)激發波長(cháng)Ca2+熒光(guāng)探針，其熒光(guāng)強度比Fluo-4強兩倍，比Fluo-3強四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+親和力，幾乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上(shàng)幾乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不僅維持Fluo-3，Fluo-4便捷的光(guāng)譜檢測特性，與Ca2+結合後的最大激發波長(cháng)為(wèi)490nm，最大發射波長(cháng)為(wèi)514nm。而且具有改善的細胞載入和Ca2+響應能(néng)力。Fluo-8加載具較弱的溫度依賴性，在室溫或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4嚴格要求在37℃孵育，此特征使其更适用于HTS高(gāo)通(tōng)量篩選實驗。Fluo-8應用廣泛，與許多(duō)細胞系和靶向樣本兼容，不會(huì)受配體或靶标本身信号幹擾。Fluo-8可通(tōng)過激光(guāng)共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光(guāng)酶标儀、熒光(guāng)顯微鏡等來檢測胞内鈣離子水(shuǐ)平的變化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一(yī)種乙酰甲酯衍生(shēng)物(wù)，具有細胞膜滲透性，隻需簡單培養，即可輕易進入細胞。一(yī)旦進入細胞内，即被其内酯酶剪切生(shēng)成不具膜滲透性的Fluo-8，從(cóng)而滞留在胞内以發揮相(xiàng)應生(shēng)理功能(néng)。本品以50μg小(xiǎo)包裝的凍幹粉形式供貨，用于細胞内Ca2+水(shuǐ)平檢測時，常用濃度為(wèi)1-5μM。

基本特性：

1）  同義名：Fluo-8, Acetoxymethyl Ester;Fluo-2, AM; Fluo-2 Medium Affinity, Acetoxymethyl Ester;

2）  化學名：Bis(acetoxymethyl) 2,2'-((4-(6-(acetoxymethoxy)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(bis(2-acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)phenoxy)ethoxy)phenyl)azanediyl)diacetate

3）  分子式：C50H50N2O23

4）  分子量：1046.93

5）  最大激發/發射波長(cháng)：490/514 nm（Ca2+結合）

6）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

7）  化學結構式：

保存與運輸方法

保存：-20℃幹燥避光(guāng)保存，有效期一(yī)年(nián)。

運輸：室溫運輸。

注意事(shì)項

1）熒光(guāng)染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光(guāng)，以減緩熒光(guāng)淬滅。

2）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出後請在幹燥的環境放(fàng)至室溫後再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請将其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）Fluo-8, AM在4℃、冰浴等較低(dī)溫度情況下(xià)會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋内，可在20-25℃溫育片刻至全部融解後使用。

4）Fluo-8, AM第一(yī)次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到(dào)≤-20℃密封幹燥凍存，以防止受潮。為(wèi)了保證良好的實驗效果，盡量在短時間内使用。

5）為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

【注意】以下(xià)使用方法僅用作參考，可根據具體的實驗條件(jiàn)做出調整。

A、試劑準備

1. 配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨号：MS4301-100MG）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱後溶解，不影響使用。

2. HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)或者其他生(shēng)理緩沖液

B，操作步驟

1. 用無水(shuǐ)DMSO溶解Fluo-8, AM配制成1-5mM的儲存液，或将已配好的Fluo-8, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fluo-8,AM中加入11.9µl無水(shuǐ)DMSO）。

2. 用HHBS或其他生(shēng)理緩沖液将Fluo-8, AM+DMSO儲存液稀釋到(dào)1-10µM的工(gōng)作液，提前加入适量的20% Pluronic F-127溶液，使其終濃度為(wèi)0.02%。

【注①】：Fluo-8, AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為(wèi)4-5µM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。為(wèi)了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上(shàng)盡量使用最低(dī)探針濃度。

【注②】：Fluo-8, AM工(gōng)作液需現配現用，避免反複凍存。

【注③】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8, AM在溶液中聚合并促使探針更好進入細胞。但Pluronic F-127可降低(dī)Fluo-8, AM的穩定性，因此隻建議在配制工(gōng)作液時加入，不建議加入儲存液長(cháng)期保存。

3.【可選】如果細胞内含有機(jī)陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能(néng)需要加入細胞培養基内，以降低(dī)去酯化探針的洩露水(shuǐ)平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲存液相(xiàng)當偏堿，因此加入培養基後需要重新調整pH。

4. 将準備好的Fluo-8, AM工(gōng)作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為(wèi)準。37℃或者室溫孵育20-60min。

【注①】：關于孵育的時間，如果首次做實驗不能(néng)确定，建議先孵育30min，看(kàn)熒光(guāng)效果；如果細胞死亡較多(duō)，适當縮短時間；如果熒光(guāng)強度太弱，适當延長(cháng)時間。

【注②】：降低(dī)探針加載溫度可能(néng)會(huì)降低(dī)探針的區室化現象。

5. 吸掉染色工(gōng)作液，并用HHBS或其他生(shēng)理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如2.5mM丙磺酸的緩沖液）替換，以去除多(duō)餘探針。

6. 用适當的儀器(qì)如激光(guāng)共聚焦、流式細胞儀、熒光(guāng)酶标儀，以及波長(cháng)Ex/Em=490/520 nm來進行檢測。

【注①】：Fluo-8, AM進入胞内後，經酯酶降解形成Fluo-8，并不是以共價結合的形式滞留在細胞質内。因此不可對加載染料的活細胞進行固定處理，再進行Ca2+水(shuǐ)平檢測。

— — Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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