近期有很多(duō)客戶使用我司（懋康生(shēng)物(wù)）的Zymolyase-20T（酵母裂解酶，酵母溶壁酶）（Cat#：MF0212），經常問到(dào)産品如何溶解，使用劑量等問題，現對以下(xià)問題做出描述。有更多(duō)的問題，請和我司聯系，或發郵件(jiàn)到(dào)tech@maokangbio.com。
常見(jiàn)問題（Frequently asked questions）：
一(yī)、 産品如何保存？
答複：本品以凍幹粉形式提供，收到(dào)産品需2-8℃幹燥保存。本品置于30℃，3個(gè)月(yuè)酶活力損失約70%。本品溶于緩沖液配制成儲存液後，短期置于2-8℃保存，約2周穩定。長(cháng)期請置于-20℃保存，約數月(yuè)穩定。
二、 凍幹粉如何溶解？
答複：本品易溶于水(shuǐ)。建議用1/15M phosphate buffer（pH 7.5）溶解，或用自(zì)己實驗體系相(xiàng)關緩沖液來溶解。儲存液的制備方法比較多(duō)，主要根據自(zì)身的實驗體系，或參考文獻來操作。短期置于2-8℃保存，約2周穩定。長(cháng)期請置于-20℃保存，約數月(yuè)穩定。
三、 如何制備無菌酶溶液？
答複：若需要制備無菌酶溶液，請用除硝酸纖維素膜之外的0.22µm孔徑的濾膜過濾除菌。
四、 酶的比活力是多(duō)少？
答複：Zymolyase-20T指的是酶的比活力約20，000 units/g (20 Ku/mg)，具體批次酶的比活力是有變化的，詳細請見(jiàn)産品标簽或質檢報(bào)告。
五、 Zymolyase适用于哪些菌株類型？
答複：該酶的裂解譜（lytic spectrum）包含以下(xià)菌屬：Ashbya（阿舒囊黴屬）, Candida（假絲酵母菌屬）, Debaryomyces（德巴利（氏）酵母屬）, Eremothecium(假囊酵母屬), Endomyces(内孢黴), Hansenula(漢遜氏酵母), Hanseniaspora(孢漢遜酵母屬), Kloeckera(克勒克酵母屬), kluyveromyces（克魯維酵母屬）, Lipomyces(油脂酵母屬), Metschnikowia(梅奇酵母屬), Pichia(畢赤酵母屬), Pullularia(芽黴菌屬), Torulopsis(球拟酵母菌), Saccharomyces(酵母屬), Saccharomycopsis(複膜酵母菌屬), Saccharomycodes(類酵母屬), Schwanniomyces(許旺酵母菌屬)，等等。其他未羅列在内的菌屬請查閱文獻或和我司聯系是否有相(xiàng)關應用數據。
六、 Zymolyase适用于絲狀真菌嗎(ma)？
答複：該酶主要用于酵母細胞壁的裂解，對于絲狀真菌，雖然與酵母細胞壁在結構上(shàng)有很多(duō)相(xiàng)似，但裂解效果因菌株類型有差異。建議用複合酶的形式來特異裂解絲狀真菌，或選用我司（懋康生(shēng)物(wù)）提供的真菌溶壁酶（Cat#:MX7356）。
七、酶的工(gōng)作濃度一(yī)般是多(duō)少？
不同的酵母菌株對酶的敏感性會(huì)有差異，請參閱文獻或根據實際的裂解經驗來設定合适的工(gōng)作濃度。操作方法可參考下(xià)方流程。
操作步驟（僅作參考，實際應用可做适當調整）：
一(yī)、Zymolyase-20T儲存液制備
此配制方法針對以下(xià)步驟來設置，也可以适用其他适當的溶劑如1/15M phosphate buffer(pH 7.5) 、10mM Tris-HCl buffer（pH 7.5）等。
将低(dī)溫保存的凍幹粉從(cóng)冰箱取出，回置室溫，低(dī)速離心後，稱取适量粉末溶于無菌S緩沖液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）配制成10mg/ml（200U/ml）儲存液，置于4℃能(néng)穩定保存2周（無菌條件(jiàn)下(xià)）。
二、制備原生(shēng)質球（Spheroplasting protocol）
2.1 室溫條件(jiàn)，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養物(wù)；
2.2 吸掉上(shàng)清，收集離心沉澱（酵母細胞），記錄濕重；
2.3 用TE緩沖液（100 mM Tris，pH 8.0，100 mM EDTA）重懸酵母細胞，按照(zhào)1.4ml/g濕重細胞加量。并用去離子水(shuǐ)定容到(dào)終體積 3.5ml/g濕重細胞。
2.4 按照(zhào)17.5 μl/g濕重細胞加入ß -巯基乙醇，目的是為(wèi)了除去細胞外層甘露聚糖層；
2.5 30°C孵育并保持低(dī)速搖晃，處于對數期生(shēng)長(cháng)的酵母孵育15min，處于穩定期生(shēng)長(cháng)的酵母孵45min；
2.7 用S緩沖液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）重懸細胞，加4.0ml S緩沖液/g濕重細胞；
2.9 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細胞）重懸細胞，另加入Zymolyases（50U/g濕重細胞，對200U/ml儲存液，則加入250μl）；初始用此酶，最好根據實際情況進行用量的優化。
2.10 30°C輕搖溫育混合液30min，根據以下(xià)方式監測原生(shēng)質球形成程度：
a）加1μl樣品到(dào)20μl S 緩沖液内，原生(shēng)質球應該保持完整；b）加1μl樣品到(dào)20μl去離子水(shuǐ)中，原生(shēng)質球應該破裂；顯微鏡下(xià)觀察比較兩個(gè)樣品。
2.11 一(yī)般情況下(xià)反應45-60min，原生(shēng)質球的形成量>90%，此時4oC下(xià)離心收集細胞，5000rpm，5min；
2.12 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細胞）重懸原生(shēng)質球，5000rpm離心5min；重複此步驟2次。
2.13 原生(shēng)質球沉澱可置于-70oC凍存。
三、酵母基因組DNA的制備（Preparation of yeast genomic DNA）
以下(xià)操作步驟簡單快速，适合于少量酵母培養物(wù)内基因組DNA的制備。
3.1 将過夜培養的10ml酵母菌培養物(wù)離心收集沉澱，加入280μl TE Buffer，300 μl 去離子水(shuǐ)和3 μl ß -巯基乙醇；
3.3 30oC溫育45min；
3.3 以台式離心機(jī)的最高(gāo)速度離心2-3s，棄上(shàng)清液，沉澱用500μl S 緩沖液重懸.；再次離心棄上(shàng)清；
3.4 用500μl含有1 mg/ml Zymolyase 20T的S緩沖液重懸沉澱（或者使用自(zì)行優化後的最佳酶濃度）；
3.5 30oC溫育1h；
3.6 重複步驟3.3；
3.7 用200μl含有0.1%SDS和2ug蛋白(bái)酶K的TE buffer重懸沉澱；
3.8 37oC溫育3小(xiǎo)時，中間時不時的混勻下(xià)溶液；
3.9 轉到(dào)65oC溫育20min；從(cóng)水(shuǐ)浴鍋内取出并冷卻至室溫；
3.10 用200μl 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從(cóng)離心機(jī)内取出并保留上(shàng)清液；
3.11 用200μl氯仿萃取上(shàng)清液，之後重複漩渦混勻及離心；
3.12 加入500μl 95%乙醇到(dào)上(shàng)清液内，20oC沉澱10min；
3.13 4oC下(xià)，15,000 xg離心20 min；
3.14 自(zì)然風幹或者于真空離心蒸發濃縮器(qì)内晾幹除去多(duō)餘的乙醇，并加入200μl TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 μg RNase A）溶解DNA；
3.15 37oC溫育1小(xiǎo)時；
3.16 重複步驟3.10和3.11；
3.17 加入2.5倍體積的95%乙醇，20oC沉澱10min；
3.18 30μl去離子水(shuǐ)重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A260，根據消光(guāng)系數計算(suàn)DNA産量；産量大約為(wèi)40-50μg。
