Luc 報(bào)告基因底物(wù)/ D-Luciferin D-螢火蟲熒光(guāng)素鉀鹽

活體成像研究/體外生(shēng)物(wù)發光(guāng)研究/轉錄水(shuǐ)平研究

搜索關鍵詞：

Luc reporter gene 報(bào)告基因；In vivo imaging 活體成像研究；轉錄水(shuǐ)平研究；熒光(guāng)素酶/ATP水(shuǐ)平研究；報(bào)告基因質粒；報(bào)告基因病毒顆粒；螢火蟲熒光(guāng)素；甲蟲熒光(guāng)素；CAS：115144-35-9；

基本描述：

D-熒光(guāng)素（D-Luciferin）是熒光(guāng)素酶（Luciferase）的常用底物(wù)，普遍用于整個(gè)生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域，特别是體内活體成像技(jì)術(shù)。作用機(jī)制是在ATP和熒光(guāng)素酶的作用下(xià)，D-熒光(guāng)素（底物(wù)）被氧化發光(guāng)。當熒光(guāng)素過量時，産生(shēng)的光(guāng)量子數與熒光(guāng)素酶的濃度呈正相(xiàng)關性（見(jiàn)下(xià)圖）。将攜帶熒光(guāng)素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染進入細胞後，導入研究動物(wù)如大小(xiǎo)鼠體内，之後注入熒光(guāng)素，通(tōng)過生(shēng)物(wù)發光(guāng)成像技(jì)術(shù)（BLI）來檢測光(guāng)強度變化，從(cóng)而實時監測疾病發展狀态或藥物(wù)的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生(shēng)物(wù)發光(guāng)強度的變化來指示能(néng)量或生(shēng)命體征。

基本應用：

D-熒光(guāng)素也常用于體外研究，包括熒光(guāng)素酶和ATP水(shuǐ)平分析；報(bào)告基因分析；高(gāo)通(tōng)量測序和各種污染檢測。

常見(jiàn)商業(yè)化類型的差異（熒光(guāng)素鉀，鈉，遊離酸）：

目前市(shì)場上(shàng)有三種産品形式，D-熒光(guāng)素（遊離酸），D-熒光(guāng)素（鈉鹽），和D-熒光(guāng)素（鉀鹽）。這三種産品主要差别在于溶解特性。

1）D-熒光(guāng)素（遊離酸）在水(shuǐ)以及緩沖體系内的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光(guāng)素（鈉鹽）和D-熒光(guāng)素（鉀鹽）能(néng)夠非常容易且快速的溶入水(shuǐ)或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特别适合體内實驗。配成溶液後的三種産品，在絕大多(duō)數應用上(shàng)都沒有實質性的差别。

3）D-熒光(guāng)素（鈉鹽）和D-熒光(guāng)素（鉀鹽）基本上(shàng)沒有差别，主要是使用習慣等因素影響。整體來看(kàn)，鉀鹽的應用文獻明顯多(duō)于鈉鹽。

D-熒光(guāng)素鉀鹽基本特性：

1）CAS NO：115144-35-9

2）化學名：4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt,D-Luciferin firefly, potassium salt

3）分子式：C11H7N2O3S2K

4）分子量：318.42 g/mol

5）純度：＞99% (HPLC)，分子生(shēng)物(wù)學級（超純）

6）外觀：淺黃色至黃色粉末

7）溶解性：溶于水(shuǐ)（60 mg/ml）

使用方法：

A．體外生(shēng)物(wù)發光(guāng)檢測

1）儲存液制備

用蒸餾水(shuǐ)溶解D-熒光(guāng)素（鉀鹽），配制成15mg/ml的儲存液（100×），混勻後立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反複凍融。建議使用的工(gōng)作液濃度為(wèi)150µg/ml（相(xiàng)當于468µM）。

2）熒光(guāng)素酶反應緩沖液制備

配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250µM CoA，150µM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻資料來調整。按照(zhào)以上(shàng)配方制備熒光(guāng)素酶反應緩沖液（2×）。

3）收集細胞裂解上(shàng)清（熒光(guāng)素酶表達）

根據需要檢測的細胞類型，選擇合适的裂解液進行細胞裂解，離心收集上(shàng)清後續檢測待用。

4）螢火蟲熒光(guāng)信号檢測

【注①】：螢火蟲熒光(guāng)信号的檢測方法大體上(shàng)取決于冷光(guāng)測定儀（luminometer）類型（是手動型熒光(guāng)計、單管注射型或者酶标闆讀(dú)數型熒光(guāng)計）。根據特定發光(guāng)測定儀，來考慮注射用量和程序設置。

【注②】：需設置不含熒光(guāng)素酶的孔（用作陰性對照(zhào)），以測定背景熒光(guāng)。

例：注射式冷光(guāng)測定儀（injectible luminometer，單樣或微孔闆，200µl終體積）

a）吸取100µl熒光(guāng)素酶反應緩沖液（2×）到(dào)一(yī)幹淨的冷光(guāng)測定儀比色皿或96孔闆的各孔（最好使用全白(bái)平底的96孔闆）；

b）吸取50~98µl裂解上(shàng)清到(dào)皿或孔内；

c） 如果有需要，用水(shuǐ)來補足使得總體積到(dào)198µl；

d）設置程序注射2µl熒光(guāng)素儲存液（使工(gōng)作濃度150µg/ml），程序：2~5秒(miǎo)延遲（delay），之後10s測定。

B．活體成像分析

1）用無菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-熒光(guāng)素（鉀鹽）工(gōng)作液（15mg/ml），0.2µm濾膜過濾除菌。混勻後立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反複凍融。一(yī)旦使用，放(fàng)到(dào)4℃解凍，保持冰冷且避光(guāng)。

2）注射量取決于注射方式，具體如下(xià)：

3）注射入體内10-20 min（待光(guāng)信号達到(dào)最強穩定平台期），再進行成像分析。

注：建議對每隻動物(wù)模型都需要建立熒光(guāng)素酶動力學曲線，從(cóng)而确定最高(gāo)信号檢測時間和信号平台期。

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注意事(shì)項

為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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