Lipo2000 Transfection Reagent 脂質體轉染試劑

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産品信息

産品描述

Lipo2000脂質體轉染試劑（Lipo2000 Transfection Reagent）是一(yī)款多(duō)用途轉染試劑，适用于核酸（DNA、RNA）的轉染，能(néng)在絕大多(duō)數貼壁和懸浮細胞（哺乳動物(wù)細胞系）提供高(gāo)效轉染。獨特的配方使其能(néng)直接加入培養基，血清的存在不會(huì)影響轉染效率。轉染後無需去除DNA- Lipo2000複合物(wù)或更換培養基，也可根據自(zì)身需求在轉染4-6h後更換新鮮培養基。

本品以無菌液體形式提供，濃度為(wèi)1mg/ml。其使用方法和Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent基本一(yī)緻，并且經過對HEK293、HeLa等細胞的轉染測試，轉染效率和Lipofectamine™ 2000相(xiàng)當。

通(tōng)常情況下(xià)，對于24孔闆的DNA轉染，每次用2μl左右，則1.5mlLipo2000約可轉染750個(gè)孔；對于24孔闆的siRNA轉染，每次用1μl左右，則1.5mlLipo2000約可轉染1500個(gè)孔；

保存與運輸方法

保存：+4℃保存，1年(nián)有效。切勿凍存。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）使用高(gāo)純的DNA或RNA有助于獲得較高(gāo)的轉染效率，内毒素是影響轉染效率高(gāo)低(dī)的重要因素。

2）使用Lipo2000脂質體轉染試劑需确保高(gāo)細胞密度，建議轉染時細胞密度達90-95%，有助于獲得最高(gāo)轉染效率和表達水(shuǐ)平，且能(néng)最小(xiǎo)化高(gāo)轉染活性導緻的細胞生(shēng)長(cháng)降低(dī)影響。可通(tōng)過優化實驗條件(jiàn)來降低(dī)細胞密度，但需注意不同實驗間維持一(yī)個(gè)标準的接種步驟，因轉染效率依賴于細胞培養密度。

3）轉染過程中不要添加抗生(shēng)素到(dào)培養基，否則會(huì)導緻細胞死亡。

4）為(wèi)了獲得最佳的轉染效率，制備轉染複合物(wù)時要求用無血清培養基（比如Opti-MEM I）稀釋DNA和轉染試劑，因血清會(huì)影響複合物(wù)的形成。其他無血清培養基（比如DMEM）也能(néng)用來稀釋DNA和轉染試劑，但轉染效率有可能(néng)會(huì)降低(dī)。另外，需要特别注意某些無血清配方會(huì)抑制Lipo2000介導的轉染，比如CD293, SFMII, VP-SFM等。

5）初次使用制備複合物(wù)時，最好優化DNA（µg）和Lipo2000脂質體轉染試劑（µl）的比例。DNA和Lipo2000的比例，絕大多(duō)數細胞系通(tōng)常推薦1:2-1:3，比如：24孔闆内接種0.5-2×105個(gè)細胞，使用0.8-1µg DNA和2-3µL Lipo2000。通(tōng)過調整DNA/ Lipo2000優化轉染效率很有必要。

6）Lipo2000脂質體轉染試劑應該在4℃保存，不可凍存。使用後立即蓋好蓋子，避免長(cháng)時間暴露在空氣中，否則有可能(néng)導緻脂質體氧化而影響轉染效率。

7）Lipo2000脂質體轉染試劑不能(néng)渦旋或離心，宜緩慢(màn)晃動混勻。

8）為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

轉染步驟（以質粒DNA的24孔闆為(wèi)例）

【注意】：對大多(duō)數細胞來說，DNA（µg）和Lipo2000（µl）的比例為(wèi)1:2~1:3。轉染時高(gāo)的細胞密度可以得到(dào)高(gāo)的轉染效率和表達水(shuǐ)平，并能(néng)減少細胞毒性。

1. 細胞準備

1）貼壁細胞：轉染前一(yī)天，用500 µl不含抗生(shēng)素的培養基接種細胞，使之在轉染時細胞達90-95%彙合（0.5~2×105 細胞/個(gè)孔，24孔闆）。

2）懸浮細胞：轉染當天，于準備DNA-Lipo2000複合物(wù)之前，用500µl不含抗生(shēng)素的培養基接種4~8×105細胞即可。

2.按照(zhào)以下(xià)體系配制DNA- Lipo2000脂質體轉染試劑複合物(wù)：

1）對于每孔細胞，在EP管内分别加入50µl無血清培養基（比如Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium）和0.8 µg DNA輕柔混勻，制成DNA稀釋液。

2）對于每孔細胞，在EP管内分别加入50µl無血清培養基（比如Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium）和2.0 µl Lipo2000（注意用前先混勻），輕柔混勻，制成Lipo2000稀釋液，室溫靜(jìng)置5min。【注意】：需要在30min内混合稀釋的DNA和Lipo2000，更長(cháng)的等待時間會(huì)降低(dī)活性。如果使用DMEM作為(wèi)稀釋培養基，那必須在5min内混合稀釋的DNA和Lipo2000。  

3）将DNA稀釋液和Lipo2000稀釋液混合（總體積100µl），輕柔混勻，室溫靜(jìng)置20min， 形成DNA-Lipo2000複合物(wù)，這一(yī)混合物(wù)可能(néng)呈渾濁狀态，但不會(huì)抑制轉染效率。【注意】：DNA-Lipo2000複合物(wù)在室溫下(xià)至少可穩定保存5h。

3.将上(shàng)方制備好的DNA-Lipo2000複合物(wù)加入接種好的細胞中，将培養闆輕輕地前後搖動，使複合物(wù)分散均勻。【注意】：如果要在無血清條件(jiàn)下(xià)轉染，使用含血清的正常培養基進行細胞接種。再加入複合物(wù)前吸掉培養基，更換為(wèi)500µl無血清培養基。

4. 37℃，5% CO2培養箱培養24-48h，直至能(néng)進行轉基因表達分析，無需去掉複合物(wù)或更換培養基。然而，有必要在4-6 h後更換生(shēng)長(cháng)培養基，不會(huì)降低(dī)轉染活性。

5.特殊說明

1）對于穩轉細胞株：則在轉染24h後，按照(zhào)1:10或更高(gāo)比例接種細胞到(dào)新鮮生(shēng)長(cháng)培養基。轉染48h後加入篩選培養基。

2）對于懸浮細胞株：在細胞中加入DNA-Lipo2000複合物(wù)後，如需要可以4h後加入PMA和/或PHA。比如：對于Jurkat細胞，分别加入PHA-L（終濃度1µg/ml）和PMA（終濃度50ng/ml），可以提高(gāo)CMV啓動子活性和基因表達。對于K562細胞，隻加入PMA（終濃度50ng/ml）足以提高(gāo)啓動子活性。

轉染體系的放(fàng)大或縮小(xiǎo)

對于不同的細胞培養闆，Lipo2000、DNA、細胞和培養基的使用量根據培養表面的不同按比例進行調整，具體參考表I。對于自(zì)動化、高(gāo)通(tōng)量體系，以96孔闆形式制備更大的複合物(wù)體積。需要注意的是，需要進行快速的96孔闆轉染（細胞鋪闆和轉染同時進行），直接在平闆中制備複合物(wù)，然後将細胞懸液加入到(dào)複合物(wù)内，這樣進一(yī)步減少了轉染時間。此種改進步驟經過293-H，293-F，COS-7L和CHO細胞的試驗，同傳統方法相(xiàng)比活性稍低(dī)。

表I.不同細胞培養容器(qì)中轉染時培養基、核酸及Lipo2000用量

【*】：不同廠商提供的細胞培養容器(qì)表面積可能(néng)有所不同。

【**】：稀釋DNA/RNA或Lipo2000所用的無血清培養基用量。

【注意】：該表用量僅供參考，具體用量請根據細胞類型、鋪闆密度等其他實驗條件(jiàn)進行優化。

附表II  Lipo2000脂質體轉染試劑用于不同細胞轉染用量參考（以96孔闆為(wèi)例）

                                                                                  — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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