TRIzol Reagent 總RNA抽提試劑

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産品關鍵詞：

TRIzol Reagent；酚氯仿抽提；RNase-free H2O； Total RNA 總RNA提取；RNAlater；Invitrogen 15596026；

産品信息

産品描述

TRIzol Reagent是一(yī)種即用型且操作迅捷的總RNA抽提試劑，适用樣本廣泛，包括人、動物(wù)、植物(wù)、酵母或細菌來源的細胞和組織樣本。TRIzol Reagent是一(yī)種含酚、異硫氰酸胍和其他專利成分的單相(xiàng)溶液，有利于抽提分子量大小(xiǎo)不一(yī)的各種RNA類型。TRIzol Reagent能(néng)夠良好的維持RNA完整性，因能(néng)高(gāo)效抑制樣本勻漿過程中細胞破損和細胞組分溶解時釋放(fàng)的RNase活性。TRIzol Reagent能(néng)夠同時處理大量樣本，且以優化的方式一(yī)步法提取RNA，整個(gè)過程可在一(yī)小(xiǎo)時内完成。

TRIzol Reagent分離的總RNA無蛋白(bái)質和DNA污染，适用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、poly(A)+篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等下(xià)遊實驗。

保存與運輸方法

保存：2-8℃保存，至少一(yī)年(nián)有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）   所有離心管、槍頭以及相(xiàng)關溶液都必須無RNase污染。對于塑料制品、玻璃和金屬器(qì)皿、實驗儀器(qì)等可使用懋康生(shēng)物(wù)的固相(xiàng)RNase清除劑去除RNase（貨号：MF0406-100ML），或者用含0.01% DEPC（貨号：MS5513-10ML）的去離子水(shuǐ)浸泡過夜，之後高(gāo)壓滅菌、烘幹。對于實驗溶液可使用懋康生(shēng)物(wù)的液相(xiàng)RNase清除劑（貨号：MF0407-1.5ML）來處理或用DEPC處理水(shuǐ)（比如：MF0404-500ML）來配制。

2）   對新鮮組織或細胞樣本的抽提效果通(tōng)常優于凍存的組織或細胞，由于組織或細胞凍融過程中可能(néng)存在一(yī)些RNase釋放(fàng)出來并酶切樣品。若是不能(néng)及時抽提RNA，推薦先加入适量TRIzol Reagent，之後裂解樣品後再凍存。

3）   TRIzol Reagent含有毒物(wù)質，請在操作過程中注意好防護工(gōng)作，戴好手套和護眼罩，避免皮膚接觸。在通(tōng)風櫥内完成操作，避免呼吸道吸入。

4）  為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

1.  需要自(zì)行準備的材料

水(shuǐ)浴鍋或微量恒溫儀（Heat block）

異丙醇

75%乙醇

含0.5% SDS的RNase-free水(shuǐ)或RNase-free水(shuǐ)或DEPC處理水(shuǐ)

【可選】RNase-free的糖原（核酸助沉劑）

2.  樣本要求

【重要】：樣本收集後立即進行RNA分離，或樣本收集後立即凍存樣本并保存在-80℃或液氮中直至RNA抽提。

3. 樣本準備與分相(xiàng)

3.1 根據起始材料用TRIzol Reagent裂解和勻漿樣本。

◇組織樣本

按比例每50~100mg 組織加1ml TRIzol Reagent，之後用合适的方法進行勻漿。通(tōng)常用50~100mg組織即可獲得足量的RNA，滿足絕大多(duō)數下(xià)遊實驗。加入過量組織或過少TRIzol都容易導緻RNA提取失敗。

a）對于研缽研磨：将液氮凍存組織，放(fàng)到(dào)研缽中研磨成粉末，之後加入1ml TRIzol，繼續研磨至組織完全裂解【研磨要迅速，最好不要超過1min】。b）對于玻璃勻漿器(qì)勻漿：加入1ml TRIzol上(shàng)下(xià)手動勻漿組織10~15次。c）對于機(jī)械勻漿器(qì)：将組織放(fàng)入塑料管内，将塑料管置于冰浴燒杯内，加入1ml TRIzol，将分散器(qì)頭垂直插入管内與組織直接接觸，設置轉速12,000~20,000 rpm，上(shàng)下(xià)移動試管10~20次，直至組織完全打散，無明顯可見(jiàn)大塊即可。

◇單層生(shēng)長(cháng)的細胞

吸盡培養基，之後往35mm培養皿（10cm2）内加入1ml TRIzol Reagent，晃動3~5次，再用移液槍上(shàng)下(xià)吹打3~5次，使其充分裂解。【按照(zhào)10cm2培養面積加入1ml TRIzol加量。比如：六孔闆每孔加入1ml TRIzol，12孔闆每孔加0.5ml TRIzol】

◇  懸浮生(shēng)長(cháng)的細胞

離心收集細胞，吸盡上(shàng)清，每5-10×106個(gè)細胞（動植物(wù)或酵母來源）或1×107個(gè)細胞（細菌來源）加入1ml TRIzol Reagent【加入TRIzol前不要清洗細胞，否則會(huì)增加mRNA降解的可能(néng)性】。用槍吹打幾次或适當渦旋，使其充分裂解。某些酵母和細菌如裂解不充分，可用勻漿器(qì)勻漿，使其完全裂解。

【注意】：樣本體積不要超過加入TRIzol體積的10%。

3.2 特殊樣本處理【可選】：對于某些富含蛋白(bái)，多(duō)糖或脂肪的樣本，經TRIzol Reagent裂解後可能(néng)會(huì)有不溶物(wù)或油脂狀漂浮物(wù)出現。此時需12,000g 4℃離心10min，之後吸取澄清的上(shàng)清液至一(yī)新的離心管中。

3.3 室溫孵育5min，使得核蛋白(bái)體完全分解。

3.4 按照(zhào)每1ml TRIzol Reagent加入0.2ml 氯仿，蓋緊蓋子。渦旋混勻或用手劇烈晃動15s，室溫孵育2~3min。

3.5 于12,000g 4℃離心15min。離心後混合物(wù)分為(wèi)三層：下(xià)層酚-氯仿層，中間層，和上(shàng)層無色的水(shuǐ)相(xiàng)層。RNA無一(yī)例外的停留在水(shuǐ)相(xiàng)層中。水(shuǐ)相(xiàng)層的容量約為(wèi)所加TRIzol Reagent體積的60%。用槍吸取上(shàng)層無色水(shuǐ)相(xiàng)到(dào)一(yī)新的離心管中，避免吸到(dào)任何中間層或下(xià)層成分。

【注意】：如果希望分離DNA和蛋白(bái)，請保留中間層和有機(jī)層。

4.      RNA分離

4.1    RNA的沉澱：a）【可選】如果起始樣本量比較少（＜106個(gè)細胞或＜10mg組織），加入5-10μg RNase-free的糖原作為(wèi)核酸助沉劑到(dào)水(shuǐ)相(xiàng)中。b）按每ml起初TRIzol Reagent加入0.5ml異丙醇，颠倒數次混勻，室溫沉澱10min。如果希望提取microRNA等小(xiǎo)RNA，推薦-70℃沉澱過夜。c）于12,000g 4℃離心10min，在管底可見(jiàn)RNA沉澱，棄上(shàng)清。

4.2    RNA的清洗：a）按每ml起初TRIzol Reagent加入1ml 75%乙醇重懸沉澱。【注：RNA在75%乙醇中-20℃至少保存1年(nián)，4℃至少1周】；b）低(dī)速漩渦或颠倒混勻，于7,500g 4℃離心5min，棄上(shàng)清。再用離心機(jī)甩一(yī)下(xià)（>5,000rpm, 離心1秒(miǎo)），小(xiǎo)心吸盡液體。c）操作的最後，簡單幹燥RNA沉澱（空氣幹燥或真空幹燥5~10min）。不要在真空管裡(lǐ)離心幹燥RNA。尤為(wèi)重要的是，不能(néng)讓RNA沉澱完全幹燥，否則會(huì)極大的降低(dī)其可溶性。部分溶解的RNA樣本的A260/A280比值＜1.6。

4.3    RNA的溶解：用20~50μl 無RNases水(shuǐ)或含0.5% SDS的無RNases水(shuǐ)溶解RNA，用槍上(shàng)下(xià)吹打2~3次，使其充分溶解，置于-70℃保存或直接用于後續實驗，如果後續要做酶切反應請勿用SDS。

【注意】：對于肝髒、胰腺、腎髒等RNase含量較高(gāo)的組織，沉澱可用100%去離子甲酰胺（貨号：MS5515-50ML）溶解。

5.      RNA産量的測定

5.1    用無RNase水(shuǐ)稀釋RNA，之後測定在260nm和280nm的吸收值。

5.2    使用公式A260×稀釋倍數×40= μg RNA/ml。

5.3    計算(suàn)A260/A280比值，比值在1.8~2.0之間視為(wèi)純度較高(gāo)，濃度＞4 μg/ml的樣品适用于分光(guāng)光(guāng)度計測定。

5.4    進行甲醛變性瓊脂糖電(diàn)泳，确定RNA的完整性和污染情況。

相(xiàng)關産品

附錄1 常見(jiàn)問題與解決方案

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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