CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit

細胞增殖與示蹤檢測試劑盒

産品關鍵詞：

CFDA, SE；Calcein AM 鈣黃綠素；Cell Division 細胞分化（分裂）；Fluorescein diacetate (FDA)；PKH26；CAS NO：150347-59-4；

産品信息

【溫馨提示】：見(jiàn)我司懋康生(shēng)物(wù)（maokangbio）提供的CFDA SE 超純凍幹粉末（#MX3009-5MG）。

産品描述

CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒（CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit）是一(yī)款基于熒光(guāng)探針CFDA, SE，用于細胞增殖檢測和細胞熒光(guāng)示蹤的檢測試劑盒。此方法目前廣泛替代MTT法或者3H-胸腺嘧啶核苷摻入法（3H-thymidine incorporation）等細胞增殖檢測方法。本試劑盒包含粉末形式的CFDA, SE探針，細胞培養級的溶劑，以及細胞标記液，使用方便，操作簡單。按照(zhào)每個(gè)樣本的标記體積為(wèi)1ml來算(suàn)，我司（懋康生(shēng)物(wù)）提供兩種規格的試劑盒，分别可檢測500個(gè)和1000個(gè)樣品。

CFDA, SE，英文全名5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CAS NO. 150347-59-4，是一(yī)種穩定的、細胞膜滲透性的非熒光(guāng)染料，由兩個(gè)醋酸基團和一(yī)個(gè)琥珀酰亞胺酯（SE）官能(néng)團組成的一(yī)個(gè)熒光(guāng)分子。一(yī)旦主動擴散進入細胞，其醋酸基團被胞内酯酶切割，生(shēng)成熒光(guāng)素酯CFSE。CFSE具有高(gāo)度熒光(guāng)，且能(néng)通(tōng)過其琥珀酰亞胺酯基團共價結合到(dào)細胞内的蛋白(bái)氨基基團。正是這個(gè)共價偶聯反應，CFSE能(néng)夠極其長(cháng)期的保留在細胞内，長(cháng)達數個(gè)月(yuè)。另外，歸因于這一(yī)穩定連接，一(yī)旦染料進入細胞，不會(huì)轉移到(dào)鄰近細胞。無活力細胞仍然是非熒光(guāng)。而活細胞一(yī)旦分化，CFSE能(néng)夠很均勻的分散到(dào)子細胞中，每分裂一(yī)次子代細胞約能(néng)得到(dào)親本細胞1/2的熒光(guāng)強度，因此，通(tōng)過流式細胞儀對熒光(guāng)強度的檢測，能(néng)夠依次分選出未分裂細胞，分裂一(yī)次的細胞（1/2熒光(guāng)強度），分裂兩次的細胞（1/4熒光(guāng)強度），分裂三次的細胞（1/8熒光(guāng)強度），以及以此類推其他分裂次數的細胞。CFSE可以檢測分裂多(duō)達8次或更多(duō)次數的細胞增殖。

CFSE廣泛用于細胞增殖和體内細胞示蹤研究。CFSE的最大激發和發射波長(cháng)分别為(wèi)492nm和517nm，标記細胞後呈綠色熒光(guāng)。使用流式細胞儀檢測可用FL1檢測通(tōng)道。也能(néng)用熒光(guāng)顯微鏡觀察，使用FITC濾片。

産品包裝

保存與運輸方法

保存：-20ºC保存，開(kāi)封前1年(nián)有效，其中組分A（CFDA SE粉末）需嚴格避光(guāng)，組分B避免強光(guāng)照(zhào)射。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）   CFDA SE溶劑在低(dī)溫（如4℃，冰浴）等條件(jiàn)下(xià)會(huì)凝固而粘在離心管底、管壁或蓋子上(shàng)，可将其置于25℃溫育片刻直至全部融解後使用。

2）   CFDA SE粉末經溶劑溶劑配制成儲存液後一(yī)個(gè)月(yuè)内用完最好，最多(duō)不超過三個(gè)月(yuè)。因CFDA SE容易被水(shuǐ)解，并在水(shuǐ)溶液中變質。使用過程中盡量避免接觸水(shuǐ)。而在标記過程中接觸到(dào)水(shuǐ)是在允許範圍内。

3）   熒光(guāng)染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光(guāng)，以減緩熒光(guāng)淬滅。

4）   為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

1.      CFDA SE儲存液（1000X）制備

a）   将低(dī)溫保存的CFDA SE粉末置于室溫回溫至少20min，之後短暫低(dī)速離心，讓所有粉末都掉落至管底。同時也提前将CFDA SE溶劑置于室溫或25℃水(shuǐ)浴片刻直至充分融解。

b）   吸取一(yī)定量CFDA SE溶劑（比如400μl）到(dào)CFDA SE粉末中，充分溶解，短暫低(dī)速離心，之後全部轉移到(dào)剩下(xià)的CFDA SE溶劑中，混勻後，此即為(wèi)CFDA SE儲存液（1000X）。此配制過程需要避光(guāng)。

c）   按照(zhào)單次用量分裝，用鋁箔紙(zhǐ)包好後，置于≤-20℃避光(guāng)幹燥保存，最好一(yī)個(gè)月(yuè)内用完，最長(cháng)不超過三個(gè)月(yuè)。-70℃保存能(néng)适當延長(cháng)保存周期。

2.      CFDA SE标記液（1X）制備

準備适量無菌的細胞培養級去離子水(shuǐ)，根據實驗需要用量，配制适量的CFDA SE标記液（1X）。比如，取10ml 細胞标記液（10X），加入90ml 去離子水(shuǐ)，充分混勻後，即得到(dào)CFDA SE标記液（1X），短期置于4℃保存，長(cháng)期不用可置于-20℃保存。

3.      染色步驟

a）   室溫300×g離心細胞5min，吸掉上(shàng)清。

b）   PBS或其他生(shēng)理緩沖液清洗細胞以去除任何殘留的血清蛋白(bái)。之後再同上(shàng)離心吸掉上(shàng)清。

c）   用1ml CFDA SE标記液（1X）重懸細胞，調整密度為(wèi)1-5 x 106cells/mL，轉移到(dào)15ml離心管内。

d）   用CFDA SE标記液（1X）将CFDA SE儲存液（1000X）稀釋到(dào)2X。比如，取2μl CFDA SE儲存液（1000X）到(dào)1ml CFDA SE标記液（1X），混勻後即為(wèi)CFDA SE儲存液（2X）。

e）   将1ml CFDA SE儲存液（2X）加入到(dào)步驟c）中含1ml 待标記細胞的15ml離心管内，輕輕混勻。

f）    37℃避光(guāng)孵育15min。【具體的孵育時間可根據實際情況做适當調整，常用孵育時間10-30min。】

g）   立即加入10ml完全細胞培養液（含血清）來淬滅染色過程，室溫颠倒幾次混勻。

h）   室溫離心去上(shàng)清，再用5-10ml完全細胞培養液清洗一(yī)次。

i）    再加入5-10ml完全細胞培養液，37℃孵育5min，以促進CFDA, SE在細胞内的充分反應和未反應的CFDA, SE重新回到(dào)完全細胞培養液中。離心去上(shàng)清，完成最後一(yī)次清洗。

j）    之後用完全細胞液重懸細胞，此時可用熒光(guāng)顯微鏡（Ex/Em=492/517nm，FITC濾片）或流式細胞儀（FL1通(tōng)道）來觀察标記效果。或開(kāi)始用藥物(wù)刺激處理或繼續常規培養。經适當時間後用流式細胞儀檢測細胞增殖，或用于特定目的的細胞示蹤。标記細胞也可用于活體動物(wù)的移植，并用熒光(guāng)進行示蹤。标記的細胞呈綠色熒光(guāng)。

常見(jiàn)應用和數據示例：

根據熒光(guāng)信号的稀釋來檢測細胞增殖和分化（示蹤）（Cell proliferation and cell division by Dye Dilution Method），此方法主要用來體内外檢測淋巴細胞（T細胞和B細胞）的增殖，也能(néng)用來檢測NK細胞，成纖維細胞甚至細菌。也有用來研究可移植造血幹細胞的增殖。

示例1（體外）.

Fig 1. Murine CD4+lymphocytes, labelled with CDFA-SE were cultured with antigen-presenting cells with different peptides to stimulate either the memory or the memory and naïve cells. Up to five cell divisions can be observed.

示例2（體内）.

Fig 2. Ability of CFSE-labeled ovalbumin (OVA)-specific T cell receptor transgenic CD8+ OT-I T cells, when adoptively transferred into C57BL/6 mice to respond to OVA, data shown 3 days after adoptive transfer. Left panel: CD8+, CD45.1+ OT-1 T cells in recipient mice. Right panel: CFSE proliferation profile. Note non-divided population of CD8+ T cells in recipient mice not receiving antigen (light grey histogram) and auto-fluorescence of non-labeled lymphocytes (dark grey histogram). The Figure depicts CD8+ T cells that have divided 1-6 times based on CFSE dilution peaks. [Quah BJ et al. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. 2010 Oct 12;(44).]

相(xiàng)關産品

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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