7-AAD Cell Cycle Analysis Kit細胞周期檢測試劑盒

産品信息

産品描述

7-AAD細胞周期檢測試劑盒（7-AAD Cell Cycle Analysis Kit）是一(yī)款采用7-AAD染色法進行細胞周期檢測的試劑盒，通(tōng)過流式細胞儀進行分析。本試劑盒通(tōng)常用于貼壁細胞或懸浮細胞的細胞周期檢測。對于組織樣品，需經消化成單細胞後才可用此試劑盒進行檢測。

7-氨基放(fàng)線菌素D（7-Aminoactinomycin D,7-AAD）是一(yī)種不具有膜滲透性的DNA結合染料（選擇性插入DNA的GC富集區），通(tōng)常被活細胞排除在外。活細胞和早期凋亡細胞排斥7-AAD不被染色，但具損傷質膜或受損/無代謝活動的細胞無法阻擋染料進入而被染色。7-AAD/DNA複合物(wù)能(néng)被488nm的氩離子激發器(qì)，發生(shēng)大的斯托克斯遷移，最大發射波長(cháng)在647nm。細胞經7-AAD染色後，假設G0/G1期細胞的熒光(guāng)強度為(wèi)1，那麽，含雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光(guāng)強度理論值為(wèi)2，正在進行DNA複制的S期細胞的熒光(guāng)強度介于1-2（見(jiàn)附圖I）。

産品組成

保存與運輸方法

保存：染色緩沖液+4℃保存，7-AAD染色液+4℃避光(guāng)保存，RNase A-20℃保存，一(yī)年(nián)有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1） 因7-AAD也能(néng)結合RNA，因此，試劑盒内提供RNase A用來降解RNA，以降低(dī)背景熒光(guāng)。然而，雖有資料顯示，7-AAD不和RNA結合，但從(cóng)我司的實驗數據來看(kàn)，添加RNase處理的效果更好。

2） 因7-AAD不具有細胞膜滲透性，則需先對細胞進行乙醇固定，再進行後續染色。

3） 請自(zì)行準備95%乙醇和PBS。

4） 熒光(guāng)染料均存在熒光(guāng)淬滅，保存和使用過程中請注意避光(guāng)，以減緩淬滅。

5） 因7-AAD對人體有刺激性，請注意适當防護。

6） 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

一(yī)、 染色步驟

1.1 細胞樣品的準備：每個(gè)樣品的細胞數量可以為(wèi)500萬以上(shàng)。

a）對于貼壁細胞：小(xiǎo)心收集細胞培養液到(dào)一(yī)幹淨離心管内備用。用胰酶消化細胞，直至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下(xià)來時，加入前面收集的細胞培養液，吹打下(xià)所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到(dào)離心管内。1000rpm離心3-5min，沉澱細胞。對于特定的細胞，如果無法完全離心至管底，可以适當延長(cháng)離心時間或稍稍加大離心速度。小(xiǎo)心吸除上(shàng)清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉澱細胞，小(xiǎo)心吸除上(shàng)清。再次加入1ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

b）對于懸浮細胞：1000rpm離心5min沉澱細胞。對于特定的細胞，如果無法完全離心至管底，可以适當延長(cháng)離心時間或稍稍加大離心速度。小(xiǎo)心吸除上(shàng)清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，并轉移到(dào)1.5ml離心管内。再次離心沉澱細胞，小(xiǎo)心吸除上(shàng)清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

c）對于組織樣本：用剪刀将組織剪成盡量小(xiǎo)的小(xiǎo)塊後，用0.25%胰酶消化30-60min（或根據實際情況選擇适當的混合酶來進行組織消化），經過200-400目細胞篩網過濾得到(dào)單細胞懸液。然後參照(zhào)步驟b）對于懸浮細胞來準備樣品。

1.2 細胞固定：取4ml冰浴預冷的95%乙醇，一(yī)邊低(dī)速渦旋震蕩的同時逐滴加入1ml細胞懸液（冰上(shàng)操作），混勻後于4℃固定2h或更長(cháng)時間，固定12~24h可能(néng)效果更佳。1500rpm離心5min沉澱細胞。對于特定的細胞，如果無法完全離心至管底，可以适當延長(cháng)離心時間或稍稍加大離心速度。小(xiǎo)心吸除上(shàng)清，可以殘留約50µl左右的乙醇固定液，以避免吸走細胞。加入約5ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉澱細胞，小(xiǎo)心吸除上(shàng)清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細胞。輕輕彈動離心管底以分散細胞避免細胞成團。

1.3 7-AAD染色工(gōng)作液的配制：參照(zhào)下(xià)表根據實際檢測樣本的數量配制足量的7-AAD染色工(gōng)作液【注意：7-AAD染色工(gōng)作液短時間可4℃保存，但需當日使用】。

1.4 染色：每管細胞樣品中加入0.1ml 7-AAD染色工(gōng)作液，緩慢(màn)并充分重懸細胞沉澱，37℃避光(guāng)孵育30min。随後可置于4℃或冰浴避光(guāng)存放(fàng)。

1.5 加入2ml PBS，1500rpm離心5min，去上(shàng)清。

1.6 加入500μl PBS，流式細胞儀上(shàng)機(jī)檢測。【請在24h内完成流式檢測，最好能(néng)在當天完成流式檢測。】

1.7 流式檢測與分析：用流式細胞儀在激發波長(cháng)488nm處檢測紅(hóng)色熒光(guāng)（7-AAD通(tōng)道或PerCP通(tōng)道），同時檢測光(guāng)散射情況。采用适當分析軟件(jiàn)進行DNA含量和光(guāng)散射分析。

【注意】：j上(shàng)機(jī)時，熒光(guāng)通(tōng)道設置為(wèi)線性放(fàng)大（Linear Scale）；k數據分析，去除粘連細胞。

相(xiàng)關産品

附圖I.典型的7-AAD細胞周期示例圖（參考用）

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海夢澤生物科技有限公司是一(yī)家涉足于生(shēng)命科學和生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)領域研究的試劑、儀器(qì)和實驗室消耗品與實驗服務工(gōng)作，主要從(cóng)事(shì)細胞生(shēng)物(wù)學、植物(wù)學、分子生(shēng)物(wù)學、免疫學、生(shēng)物(wù)化學、蛋白(bái)組學。生(shēng)物(wù)制藥與診斷試劑研發生(shēng)産等領域。 本公司秉承“以人為(wèi)本，以誠為(wèi)信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為(wèi)廣大客戶提供優質産品。