Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue

硬組織線粒體分離試劑盒

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基本描述

硬組織線粒體分離試劑盒（Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue）是一(yī)款快速便捷的分離動物(wù)硬組織（如：骨骼肌）線粒體的試劑盒。本試劑盒在分離線粒體的同時，還(hái)能(néng)獲得不含線粒體的細胞漿蛋白(bái)，可用于分析細胞色素c等線粒體蛋白(bái)向胞漿的釋放(fàng)。經本試劑盒獲得的大部分線粒體都含有完整的内膜和外膜，且維持線粒體生(shēng)理功能(néng)，因此，分離所得的線粒體可用于線粒體膜電(diàn)位等生(shēng)理功能(néng)相(xiàng)關研究。另外，分離得到(dào)的線粒體也可被線粒體裂解液或其它适當裂解液裂解後用于SDS-PAGE、Western、雙向電(diàn)泳等蛋白(bái)分析。

本試劑盒适用于從(cóng)動物(wù)硬組織（比如：心肌、骨骼肌）或其他難以分離線粒體的組織中提取線粒體。

産品組分

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年(nián)穩定。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1） 進行實驗之前務必閱讀(dú)試劑盒操作流程，根據最終實驗目的選擇試劑盒内所要用到(dào)的試劑。

2） 若不是用于制備線粒體蛋白(bái)樣品，不必往線粒體裂解液和清洗液中加PMSF。

3） 分離線粒體的所有步驟均需在冰上(shàng)或4℃進行，所用溶液需冰浴或4℃預冷，全部操作時間盡量控制在1h之内。

4） 通(tōng)常，在分離線粒體時前後兩次離心速度選取1000g和12,000g，如果希望純度更高(gāo)，但對線粒體的得率要求不高(gāo)，前後兩次離心速度可以采用2000g和6000g。

5） 試劑開(kāi)封後請盡快使用，以免影響後續實驗效果。

6） 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

自(zì)備材料

1）（可選）BCA蛋白(bái)定量檢測試劑盒或Bradford蛋白(bái)濃度測定試劑盒

2）尼龍網或細胞篩

3）低(dī)速離心機(jī)

4）勻漿器(qì)

使用方法

1. 試劑準備：從(cóng)冰箱取出所需試劑置于室溫融解，之後立即置于冰上(shàng)待用。需要注意，如果實驗目的是為(wèi)了制備線粒體蛋白(bái)樣品，需在線粒體裂解緩沖液和清洗液内添加PMSF (100×)，使其終濃度為(wèi)PMSF (1×)。PMSF一(yī)定要在試劑加入到(dào)樣品前1-2min内加入，以免PMSF在水(shuǐ)溶液中失效。

2. 清洗：動物(wù)禁食24h後處死，取新鮮橫紋肌等組織（不宜采用凍存組織），迅速稱重50~100mg，用預冷的清洗液清洗2次，棄清洗液，于冰上(shàng)剪成30mm2大小(xiǎo)的組織碎片。

3. 裂解：加入10倍體積預冷的線粒體裂解液，置于冰浴5-10min。

4. 勻漿I：轉移到(dào)預冷的Dounce勻漿器(qì)中，勻漿10-20次。或采用電(diàn)動勻漿器(qì)，700rpm，8-10次。不同組織或不同勻漿器(qì)所需的勻漿次數有所不同，需自(zì)行優化。【注意】：如果組織重量為(wèi)100mg，可以粗略認為(wèi)組織的體積接近100μl，此時需加入1000μl線粒體裂解液。

5. 勻漿II：4℃攪拌孵育5-10min。用等體積的線粒體儲存液稀釋至勻漿液，再次重複步驟4。

6. 離心：用尼龍網或細胞篩網過濾勻漿液，4℃ 1000g離心15min，重複1次，以去除細胞核、未破碎細胞和大的膜碎片。【注意】：如需獲得純度更高(gāo)的線粒體，可以将此步驟的離心速度改為(wèi)2000g離心10min，缺點是相(xiàng)同數量細胞的線粒體抽提得率會(huì)下(xià)降。

7. 上(shàng)清液轉移至一(yī)幹淨離心管，4℃ 12000g離心10min。【注意】：如需獲得純度更高(gāo)的線粒體，可以将此步驟的離心速度改為(wèi)6000g離心10min，缺點是相(xiàng)同數量細胞的線粒體抽提得率會(huì)下(xià)降。

8. 棄上(shàng)清，沉澱即為(wèi)線粒體。【注意】：如果希望獲得去除線粒體後的細胞漿蛋白(bái)，應在本步驟中收集上(shàng)清，且在收集上(shàng)清的過程中不要觸及沉澱，随後把收集的上(shàng)清4℃ 12000g 離心10min，此時的上(shàng)清即為(wèi)去除線粒體的細胞漿蛋白(bái)。

9. 保存：棄上(shàng)清，用适當的緩沖液懸浮沉澱。如果用于線粒體酶活性或功能(néng)分析，線粒體沉澱需重懸于線粒體保存液中；如果用于細胞漿蛋白(bái)的分析，獲得的細胞漿蛋白(bái)應保存于蛋白(bái)保存液（1×），即按照(zhào)：細胞漿蛋白(bái)：蛋白(bái)保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于雙向電(diàn)泳，應使用其它适宜的保存液。

【注意】：使用本試劑盒中的線粒體儲存液稀釋或儲存的線粒體樣品應及時使用，以免線粒體膜電(diàn)位受影響。如果不能(néng)及時使用，建議在-80℃保存。凍存後的線粒體樣品不推薦用于膜電(diàn)位的檢測，但可以用線粒體蛋白(bái)或核酸的相(xiàng)關檢測。

相(xiàng)關産品

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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