Caspase-9 Activity Assay Kit (Fluorometric)

 Caspase-9活性檢測試劑盒（熒光(guāng)法）

産品信息

産品描述

Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一(yī)個(gè)高(gāo)度保守的半胱氨酸蛋白(bái)酶家族，特異性識别底物(wù)中的天冬氨酸殘基，在介導細胞凋亡的過程中發揮著(zhe)非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達，通(tōng)過自(zì)發蛋白(bái)分解機(jī)制或經其他蛋白(bái)酶（通(tōng)常是其他caspases）加工(gōng)處理的方式被活化。人caspases可細分為(wèi)三大功能(néng)組：細胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啓動（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執行（caspase-3，-6和-7）。

Caspase-9（Caspase9），也稱為(wèi)Mch6，ICE LAP6和Apaf3，作為(wèi)caspases家族的成員(yuán)之一(yī)，含CARD結構域（caspase募集結構域），是細胞凋亡信号轉導過程中比較上(shàng)遊的一(yī)個(gè)caspase。Caspase-9酶原分子量約47kDa，存在于胞漿内，一(yī)旦活化，轉移到(dào)線粒體。Caspase-9參與caspase活化級聯，負責凋亡執行，和切割/活化下(xià)遊的caspase-3和caspase-6。當募集到(dào)Apaf1/細胞色素c複合物(wù)後，caspase-9被激活。Caspase-9的激活可通(tōng)過磷酸化進行調控。

Caspase-9活性檢測試劑盒（熒光(guāng)法）（Caspase-9 Activity Assay Kit, Fluorometric or Caspase-9 Fluorometric Assay Kit）以偶聯上(shàng)發色基團AFC的caspase-9序列特異性的多(duō)肽為(wèi)底物(wù)。當底物(wù)被caspase-9剪切後，發色基團被釋放(fàng)出來，進而用熒光(guāng)酶标儀或熒光(guāng)光(guāng)度計來測定其熒光(guāng)強度（激發波長(cháng)=485nm，發射波長(cháng)=535nm）。通(tōng)過計算(suàn)RFU凋亡誘導組/RFU陰性對照(zhào)組的比值來确定凋亡誘導組caspase-9的活化程度。

本品适用于培養細胞以及新鮮組織的caspase-9活性檢測。

産品包裝

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年(nián)有效。開(kāi)盒後置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-9 Substrate和0.1M DTT需要避光(guāng)凍存。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1） Caspase-9 Substrate需避光(guāng)保存和使用。

2） 某些凋亡誘導劑誘導的凋亡可能(néng)通(tōng)過caspase-9非依賴的方式進行，此種情況使用本品檢測的caspase-9活性無明顯變化，則，需要考慮凋亡機(jī)制中的其他信号通(tōng)路(lù)。

3） 起始細胞數量需達3~5×106個(gè)或新鮮組織量達50~100mg，以保證達到(dào)測定所需的100~200μg蛋白(bái)量。Caspase-9的活性與細胞裂解後的蛋白(bái)含量有關，如測定的RFU值偏低(dī)，可通(tōng)過适當延長(cháng)反應時間來操作。但如果測定的RFU值依然不高(gāo)，則要通(tōng)過增加細胞數量或組織量的方法來提高(gāo)蛋白(bái)量。

4） 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

1.需要的其他試劑和材料

儀器(qì)：低(dī)溫高(gāo)速離心機(jī)、熒光(guāng)酶标儀、微量移液器(qì)、玻璃勻漿器(qì)（組織樣本）

耗材：1.5ml微量離心管、白(bái)色或黑(hēi)色（不透明、平底）的96孔酶标闆

試劑：PBS、蛋白(bái)定量試劑（比如：Bradford法蛋白(bái)濃度測定試劑盒）、ddH2O

2.試劑準備

2.1 Lysis Buffer（含DTT）

于實驗前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工(gōng)作液，置于4℃或冰上(shàng)待用。

2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）

于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的反應工(gōng)作液。

2.3 Caspase-9 Substrate工(gōng)作液

将Caspase-9 Substrate從(cóng)冰箱内取出，置于室溫（或25℃水(shuǐ)浴）使其充分融化，低(dī)速離心使其沉至管底。于使用前，按照(zhào)19.5μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl Caspase-9 Substrate的比例準備足量的Caspase-9 Substrate工(gōng)作液。

3.樣本準備

3.1 細胞裂解

a）用合适方法誘導細胞凋亡，同時設立陰性對照(zhào)組（不加誘導劑），收集3~5×106個(gè)細胞。

b）PBS洗滌細胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上(shàng)清。

c）往離心的沉澱細胞中加入100μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。

d）置冰上(shàng)裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。

e）4℃，10,000rpm離心1min。

f）小(xiǎo)心吸取上(shàng)清（含裂解釋放(fàng)的蛋白(bái)質）轉移到(dào)新的EP管内，置于冰上(shàng)待用。

g）取少量上(shàng)清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白(bái)濃度。

3.2 組織裂解

a）取50~100mg組織置于培養皿内，用手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小(xiǎo)塊，加入150~200μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器(qì)上(shàng)下(xià)手動勻漿15次，注意低(dī)溫操作。

b）将組織勻漿液轉移到(dào)1.5ml預冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。

c）小(xiǎo)心吸取上(shàng)清（含裂解釋放(fàng)的蛋白(bái)質）轉移到(dào)新的EP管内，置于冰上(shàng)待用。

d）取少量上(shàng)清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白(bái)濃度。

4.Caspase-9活性檢測

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