LDH Cytotoxicity Assay Kit

乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒

産品信息

産品描述

乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放(fàng)檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一(yī)種基于diaphorase催化的INT顯色反應，通(tōng)過比色法檢測細胞毒性時釋放(fàng)的乳酸脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。

 本試劑盒可以用于常規的乳酸脫氫酶活性的檢測，更常用于以LDH釋放(fàng)為(wèi)指标的細胞毒性檢測。同時，基于細胞總乳酸脫氫酶活性的檢測，本試劑盒也可以用于檢測細胞增殖和細胞毒性檢測。

細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的破壞會(huì)導緻細胞漿内的酶釋放(fàng)到(dào)培養液裡(lǐ)，其中包括酶活性較為(wèi)穩定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通(tōng)過檢測從(cóng)質膜破裂的細胞中釋放(fàng)到(dào)培養液中的LDH的活性，就(jiù)可以實現對細胞毒性的定量分析。LDH釋放(fàng)被看(kàn)做細胞膜完整性的重要指标，并被廣泛用于細胞毒性檢測。LDH釋放(fàng)被認為(wèi)是以前使用放(fàng)射性的51Cr标記細胞，随後通(tōng)過51Cr釋放(fàng)進行細胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。

本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下(xià)，NAD+被還(hái)原生(shēng)成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應生(shēng)成NAD+和強生(shēng)色物(wù)甲臜(formazan)，在490nm波長(cháng)下(xià)産生(shēng)吸收峰，從(cóng)而通(tōng)過比色來定量檢測細胞培養液、細胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。吸光(guāng)度與乳酸脫氫酶活性成線性正相(xiàng)關。該酶聯反應原理的示意圖如下(xià)：

産品組分

保存與運輸方法

保存：-20℃避光(guāng)保存，1年(nián)有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）    冷凍會(huì)使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放(fàng)置2-3天。建議樣品準備好後盡量當天完成測定。

2）    如果檢測細胞培養液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過1%，并最好使用熱滅活血清。如果一(yī)定需要使用10%血清，在檢測時一(yī)定要設置沒有細胞，但加入了相(xiàng)同體積培養液的對照(zhào)孔，以用于消除背景。

3）    細胞過度生(shēng)長(cháng)、密度過高(gāo)、離心速度過大、培養箱内外溫差過大，都會(huì)造成細胞釋放(fàng)乳酸脫氫酶增加。

4）    如果希望進行乳酸脫氫酶活性的絕對定量，用戶需自(zì)備乳酸脫氫酶标準品。

5）    為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法

一(yī)、樣本的準備

1.     LDH釋放(fàng)檢測

1.1)  根據細胞的大小(xiǎo)和生(shēng)長(cháng)速度将适量細胞接種到(dào)96孔細胞培養闆中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。
1.2)吸去培養液，用PBS液洗滌一(yī)次。換新鮮培養液(推薦使用含1%血清的低(dī)血清培養液或适當的無血清培養液)，将各培養孔分成如下(xià)幾組：包括無細胞的培養 液孔(背景空白(bái)對照(zhào)孔)，未經藥物(wù)處理的對照(zhào)細胞孔(樣品對照(zhào)孔)，未經藥物(wù)處理的用于後續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照(zhào)孔)，以及藥物(wù)處理的細胞 孔(藥物(wù)處理樣品孔)，并做好标記。按照(zhào)實驗需要給予适當藥物(wù)處理(如加入0-10μl左右特定的藥物(wù)刺激，可設置不同濃度，不同處理時間，對照(zhào)孔中需加 入适當的藥物(wù)溶劑對照(zhào))，繼續按常規培養。到(dào)預定的檢測時間點前1小(xiǎo)時，從(cóng)細胞培養箱裡(lǐ)取出細胞培養闆，在“樣品最大酶活性對照(zhào)孔”中加入試劑盒提供 的LDH釋放(fàng)試劑，加入量為(wèi)原有培養液體積的10%。加入LDH釋放(fàng)試劑後，反複吹打數次混勻，然後繼續在細胞培養箱中孵育。
1.3)到(dào)達預定時間後，将細胞培養闆用多(duō)孔闆離心機(jī)400g離心5min。分别取各孔的上(shàng)清液120μl，加入到(dào)一(yī)新的96孔闆相(xiàng)應孔中，随即進行樣品測定。

2.     細胞内總LDH的檢測

2.1) 細胞毒性檢測：根據細胞的大小(xiǎo)和生(shēng)長(cháng)速度将适量細胞接種到(dào)96孔細胞培養孔闆中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物(wù)進行處理，并設 置适當對照(zhào)。藥物(wù)刺激完畢後，将細胞培養闆用多(duō)孔闆離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上(shàng)清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放(fàng)試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放(fàng)試劑并混勻)，适當搖晃培養闆混勻，然後繼續在細胞培養箱中孵育1小(xiǎo)時。随後将細胞培養闆用多(duō)孔闆離心機(jī)400g離心5min。分 别取各孔的上(shàng)清液120μl，加入到(dào)一(yī)新的96孔闆相(xiàng)應孔中，随即進行樣品測定。

2.2) .細胞增殖檢測：根據細胞的大小(xiǎo)和生(shēng)長(cháng)速度将适量細胞接種到(dào)96孔細胞培養孔闆中，使促進細胞增殖的藥物(wù)刺激後細胞不超過80-90%滿為(wèi)宜。使用不同的 藥物(wù)刺激細胞，并設置适當對照(zhào)。藥物(wù)刺激完畢後，将細胞培養闆用多(duō)孔闆離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上(shàng)清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供 的LDH釋放(fàng)試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放(fàng)試劑并混勻)，适當搖晃混勻胞，然後繼續在細培養箱中孵育1小(xiǎo)時。随後将細胞培養闆用多(duō)孔闆離心機(jī)400g離 心5min。分别取各孔上(shàng)清液120μl，加入到(dào)一(yī)新的96孔闆相(xiàng)應孔中，随即進行樣品測定。

注：LDH釋放(fàng)檢測更加常用一(yī)些，細胞内總LDH檢測通(tōng)常可以使用MTT、WST-1或CCK-8等方法替代。

二、試劑盒的準備

1) INT溶液(1X)的配置：根據所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液 ，混勻後即配置為(wèi)200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現配現用，配置後4℃保存可于當天使用，不宜配置後凍存。
2) LDH檢測工(gōng)作液的配制:根據待測定的樣品數(含對照(zhào))，參考下(xià)表在臨檢測前新鮮配制适量的檢測工(gōng)作液。
注意：LDH檢測工(gōng)作液必須現配現用，配制和使用過程中均要注意适當避光(guāng)。

3) (選做)如果希望進行LDH酶活性的絕對定量，需自(zì)備LDH标準品，并新鮮配制不同濃度LDH标準品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、0.65mU/ml、0 mU/ml。

三、樣品的測定

1) 各孔分别加入60μl LDH檢測工(gōng)作液。
2)混勻，室溫(約25℃)避光(guāng)孵育30min(可用鋁箔包裹後置于水(shuǐ)平搖床或側擺搖床上(shàng)緩慢(màn)搖動)。然後在490nm處測定吸光(guāng)度。使用600nm或大于600nm的任一(yī) 波長(cháng)作為(wèi)參考波長(cháng)進行雙波長(cháng)測定。
3)計算(suàn)(測得的各組吸光(guāng)度均應減去背景空白(bái)對照(zhào)孔吸光(guāng)度)
4)細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光(guāng)度－樣品對照(zhào)孔吸光(guāng)度) / (細胞最大酶活性的吸光(guāng)度－樣品對照(zhào)孔吸光(guāng)度)×100
5)可繪制細胞毒性曲線：縱坐标為(wèi)實際吸光(guāng)度，橫坐标為(wèi)藥物(wù)濃度；據此可計算(suàn)該藥物(wù)作用特定時間的半緻死劑量LD50。

附錄I：

可同時測定一(yī)已知濃度的LDH酶标準品對應的吸光(guāng)度值，參考以下(xià)公式粗略計算(suàn)出樣品中LDH酶活力：
待測樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝
(樣品孔吸光(guāng)度－背景空白(bái)對照(zhào)孔吸光(guāng)度) / (标準管吸光(guāng)度－标準空白(bái)管吸光(guāng)度)×标準品濃度(mU/ml)；
根據計算(suàn)結果可以比較不同樣品處理組間有無統計學差異等。

附錄II：

若需準确計算(suàn)出LDH酶活性的絕對活性，可通(tōng)過一(yī)系列LDH标準品及相(xiàng)應測得的吸光(guāng)度值繪制标準曲線，通(tōng)過标準曲線相(xiàng)應公式計算(suàn)出樣品中LDH的酶活性。 
各孔數值減去空白(bái)對照(zhào)後，以檢測的吸光(guāng)度(OD490)為(wèi)縱坐标，LDH酶活力(mU)為(wèi)橫坐标，繪制LDH标準曲線。同時計算(suàn)出該趨勢線的公式。

A490nm＝k×LDH酶活力單位(mU)＋b，通(tōng)過Excel等軟件(jiàn)計算(suàn)出趨勢線的斜率k和截距b。
根據上(shàng)述公式計算(suàn)樣品中LDH活力。
樣品實際吸光(guāng)度(OD490)＝樣品孔測得的吸光(guāng)度－背景空白(bái)對照(zhào)孔吸光(guāng)度
檢測體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/ml)＝檢測體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測樣品體積

相(xiàng)關産品