GT115 Electrocompetent Cell

大腸杆菌電(diàn)轉感受态細胞

産品标簽：

GT115電(diàn)擊感受态細胞；TOP10；DH5α Electrocompetent Cell；DH10B；XL1-Blue；1mm電(diàn)轉杯（電(diàn)擊杯）；Biorad 1652083；

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菌株描述

GT115菌株是一(yī)款特别開(kāi)發用于含R6Kγ複制原點和攜帶發夾結構等二級結構的質粒DNA進行克隆和擴增的大腸杆菌菌株。GT115含pir基因，可以編碼利用R6Kγ為(wèi)複制子的載體所必需的π蛋白(bái)。發夾結構在大腸杆菌内是很不穩定的，因為(wèi)菌體内存在的SbcCD蛋白(bái)複合體會(huì)識别并切除發夾結構。通(tōng)過基因突變删除大腸杆菌内的sbcC和sbcD基因，能(néng)顯著改善含發夾結構質粒重組克隆的穩定性和拷貝數。rpsL(StrA)基因賦予菌株鏈黴素抗性。

GT115菌株基因型： F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrA) endA1 ∆dcm uidA(∆MluI)::pir-116 ∆sbcC-sbcD 

産品描述

我司（懋康生(shēng)物(wù)）提供的GT115電(diàn)轉感受态細胞經特殊工(gōng)藝制作，經pUC19質粒（AmpR）檢測轉化效率>1×1010 cfu/μg DNA。且在-80℃能(néng)穩定保存幾個(gè)月(yuè)轉化效率不發生(shēng)改變。

産品包裝

保存與運輸條件(jiàn)：

保存：-80℃保存，六個(gè)月(yuè)有效。

運輸：幹冰運輸。

注意事(shì)項

1） 感受态細胞最好保存在-80℃以下(xià)，不可反複凍融和放(fàng)置時間過長(cháng)，以免降低(dī)感受态細胞的轉化效率。

2） 整個(gè)轉化操作，嚴格根據相(xiàng)應溫度及無菌條件(jiàn)要求進行。

3） 加入DNA的體積不應大于感受态體積的1/10。DNA不純或存在鹽、乙醇、蛋白(bái)及緩沖液等污染時，會(huì)導緻轉化效率急劇下(xià)降。

4） 為(wèi)确保最高(gāo)轉化效率，整個(gè)操作過程應盡量輕柔，并保持低(dī)溫。

5） 電(diàn)擊感受态細胞加入電(diàn)擊杯應避免産生(shēng)氣泡，氣泡會(huì)增加弧光(guāng)放(fàng)電(diàn)風險。

6） 電(diàn)擊杯裡(lǐ)的離子可增加溶液的電(diàn)導，增大在含有細胞和DNA的溶液中産生(shēng)電(diàn)流和弧光(guāng)放(fàng)電(diàn)的風險。

7） 若轉化大質粒或想獲得較高(gāo)轉化效率，推薦使用高(gāo)純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一(yī)倍，轉化效率下(xià)降一(yī)個(gè)數量級。

8） 對于連接産物(wù)轉化：最好在轉化前乙醇沉澱DNA後用适量TE緩沖液重懸産物(wù)，保證DNA濃度不超過100ng/μl。過高(gāo)濃度連接産物(wù)或過大體積連接産物(wù)會(huì)降低(dī)轉化效率，增加弧光(guāng)放(fàng)電(diàn)的風險。

9） 混入質粒時應輕柔操作，吸取感受态細胞時不可用孔徑過小(xiǎo)的槍頭（普通(tōng)200μl槍頭應剪去槍頭尖0.6cm）。避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低(dī)轉化效率。轉化高(gāo)濃度的質粒或連接産物(wù)可相(xiàng)應減少最終用于塗闆的菌量。

10） 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無菌條件(jiàn)的标準下(xià)進行】

1) 将0.1 cm電(diàn)擊杯和杯蓋從(cóng)儲存液中拿出倒置于幹淨吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)5min，待其瀝幹水(shuǐ)分，正置5min，使乙醇充分揮發幹淨，立即插入冰中，壓實冰面，電(diàn)極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上(shàng)杯蓋，冰中靜(jìng)置5min使其充分降溫。

2) 取-80℃保存的感受态細胞插入冰中5min，待其完全融化。

3) 往50μl感受态細胞懸液中加入目的DNA（質粒或連接産物(wù)），用手撥打管底使其混勻，避免産生(shēng)氣泡，立即插入冰中。

【注意】：要測定轉化效率，請使用1μl pUC19 Control Vector (10pg/μl)。

【注意】：對于連接産物(wù)，部分公司的T4連接酶體系或50℃重組體系不用純化，可直接與GT115電(diàn)轉感受态細胞混合後進行電(diàn)擊轉化，需控制DNA濃度≤100ng/μl，體積≤5μl/50μl感受态細胞。

【注意】：對鹽濃度較高(gāo)的DNA溶液或反應體系需用膜純化或乙醇沉澱純化DNA，之後加入ddH2O重懸，然後與電(diàn)擊感受态細胞混合進行電(diàn)擊轉化。

4) 用槍（注意所用的槍頭用剪刀剪掉0.5cm尖頭）輕輕吹打混勻感受态細胞-DNA之後快速轉移到(dào)電(diàn)擊杯中，避免産生(shēng)氣泡，輕輕晃動使液面保持水(shuǐ)平，蓋上(shàng)杯蓋，插入冰中。

5) 啓動電(diàn)轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV（此參數參考Bio-rad，具體使用請參考電(diàn)轉儀推薦參數來操作），将電(diàn)擊杯從(cóng)冰内取出，用吸水(shuǐ)紙(zhǐ)擦幹表面水(shuǐ)漬，放(fàng)入電(diàn)轉槽中，電(diàn)擊完成後取出電(diàn)擊杯放(fàng)室溫。打開(kāi)杯蓋，15s内加入900μl無抗生(shēng)素的無菌S.O.C.培養基（已提前預熱到(dào)37℃，每管感受态準備10ml S.O.C.培養基），用1ml槍吹吸電(diàn)擊杯底部數次混勻後，轉移到(dào)50ml離心管，向離心管内補加預熱的S.O.C.培養基定容至10ml。于37℃，225rpm振蕩複蘇培養1h。

【注意】：S.O.C.培養基配方: 2% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20mM glucose。S.O.C.培養基營養豐富，主要用于大腸杆菌感受态細胞轉化的複蘇步驟，能(néng)最大化感受态細胞的轉化效率。

6) 5,000rpm離心1min，重懸後取100~200μl加到(dào)含相(xiàng)應抗生(shēng)素的S.O.C.平闆上(shàng)（因菌量較大，若全部塗闆請選用直徑150mm培養皿2~5個(gè)），用無菌玻棒輕輕的将細胞均勻塗開(kāi)。室溫正置10 min，待液體被吸收後，倒置平闆，37℃過夜培養13~17h。 

相(xiàng)關産品

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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