Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells

細胞線粒體分離試劑盒

産品信息

産品描述

細胞線粒體分離試劑盒（Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells）是一(yī)款快速便捷的分離培養細胞内線粒體的試劑盒。本試劑盒在分離線粒體的同時，還(hái)能(néng)獲得不含線粒體的細胞漿蛋白(bái)，可用于分析細胞色素c等線粒體蛋白(bái)向胞漿的釋放(fàng)。經本試劑盒獲得的大部分線粒體都含有完整的内膜和外膜，且維持線粒體生(shēng)理功能(néng)，因此，分離所得的線粒體可用于線粒體膜電(diàn)位等生(shēng)理功能(néng)相(xiàng)關研究。另外，分離得到(dào)的線粒體也可被線粒體裂解液或其它适當裂解液裂解後用于SDS-PAGE、Western、雙向電(diàn)泳等蛋白(bái)分析。

産品組分

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年(nián)穩定。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1）   進行實驗之前務必閱讀(dú)試劑盒操作流程，根據最終實驗目的選擇試劑盒内所要用到(dào)的試劑。

2）   若不是用于制備線粒體蛋白(bái)樣品，不必往線粒體裂解液和清洗液中加PMSF。

3）   分離線粒體的所有步驟均需在冰上(shàng)或4℃進行，所用溶液需冰浴或4℃預冷，全部操作時間盡量控制在1h之内。

4）   通(tōng)常，在分離線粒體時前後兩次離心速度選取1000g和15,000g，如果希望純度更高(gāo)，但對線粒體的得率要求不高(gāo)，前後兩次離心速度可以采用2000g和6000g。

5）   細胞計數（如台盼藍染色）對于不同實驗不必全部使用，實驗條件(jiàn)成熟後可不用。

6）   為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

自(zì)備材料

1）（可選）胰酶-EDTA細胞消化液

2）（可選）台盼藍染色液

3）（可選）BCA蛋白(bái)定量檢測試劑盒

4）PBS

5）低(dī)速離心機(jī)

6）勻漿器(qì)

使用方法

1.      試劑準備：從(cóng)冰箱取出所需試劑置于室溫融解，之後立即置于冰上(shàng)待用。需要注意，如果實驗目的是為(wèi)了制備線粒體蛋白(bái)樣品，需在線粒體裂解緩沖液和清洗液内添加PMSF (100×)，使其終濃度為(wèi)PMSF (1×)。PMSF一(yī)定要在試劑加入到(dào)樣品前1-2min内加入，以免PMSF在水(shuǐ)溶液中失效。

2.      收集細胞：

2.1 對于貼壁細胞：用預冷的PBS清洗細胞1次，胰酶消化，100-200g 4℃離心5-10min收集細胞。

2.2 對于懸浮細胞：直接離心收集細胞。

3.      清洗：用預冷的PBS輕輕重懸細胞沉澱，如有必要，取少量細胞用于計數。剩餘細胞600g 4℃離心5min沉澱細胞，棄上(shàng)清。【注意】：單個(gè)樣品細胞量≥106個(gè)，一(yī)般控制在2-5×107個(gè)。

4.      裂解：往沉澱内加入1-2ml預冷的線粒體裂解液重懸細胞，冰内孵育10-15min，可用相(xiàng)差顯微鏡檢測細胞膨脹程度。

5.      勻漿：把細胞懸液轉移到(dào)Dounce勻漿器(qì)中，勻漿10-20次。不同細胞或不同勻漿器(qì)所需的勻漿次數有所不同，需自(zì)行優化。【注意】：通(tōng)常，可以在勻漿10次後取約2μl細胞勻漿，加入30-50μl台盼藍染色液，混勻後顯微鏡下(xià)觀察台盼藍染色陽性（藍色）細胞的比例。如果陽性細胞比例不足50%，增加5次勻漿。随後再同前取樣進行台盼藍染色鑒定。當陽性比例超過50%時即可停止勻漿進入下(xià)一(yī)步。請勿過度勻漿，過度勻漿會(huì)導緻線粒體的機(jī)械損傷。同時記錄對于該細胞的勻漿次數，通(tōng)常在後續實驗時不必再摸索勻漿次數。

6.       取勻漿液，立即加入等量清洗液，輕輕颠倒混勻數次。

7.       4℃ 1300g離心5min以去除細胞核、未破碎細胞和大的膜碎片。

8.       上(shàng)清液轉移至一(yī)幹淨離心管，4℃ 1000g離心5min，重複2次。

9.       上(shàng)清液轉移至一(yī)幹淨離心管，4℃ 12000-15000g離心15min，重複1次。

10.    棄上(shàng)清，沉澱即為(wèi)線粒體。需注意，如果希望獲得去除線粒體後的細胞漿蛋白(bái)，應在本步驟中收集上(shàng)清，且在收集上(shàng)清的過程中不要觸及沉澱，随後把收集的上(shàng)清4℃ 12000g 離心10min，此時即得到(dào)去除線粒體的細胞漿蛋白(bái)。

11.    保存：棄上(shàng)清，用适當的緩沖液懸浮沉澱。如果用于線粒體酶活性或功能(néng)分析，線粒體沉澱需重懸于線粒體保存液中；如果用于細胞漿蛋白(bái)的分析，獲得的細胞漿蛋白(bái)應保存于蛋白(bái)保存液（1×），即按照(zhào)：細胞漿蛋白(bái)：蛋白(bái)保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于雙向電(diàn)泳，應使用其它适宜的保存液。

相(xiàng)關産品