PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜标記）

産品關鍵詞：

PKH67；PKH26；Calcein AM鈣黃綠素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking體内細胞示蹤；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

産品信息

【好消息】：應客戶的要求，我司對試劑盒内的Diluent C可單獨供應，産品信息如下(xià)：

産品描述

PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜标記）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一(yī)款基于熒光(guāng)探針PKH67，用于常規細胞膜标記的檢測試劑盒，适用于體外細胞标記，體外細胞增殖以及長(cháng)期的體内細胞跟蹤研究等。

PKH67是一(yī)種專利的膜标記探針，與PKH1和PKH2相(xiàng)比，結構上(shàng)帶有更長(cháng)的脂肪族碳尾，能(néng)穩定插入細胞膜脂質區域。正因具更長(cháng)碳尾，内部數據連續性證明：PKH67具有比PKH2更低(dī)的細胞-細胞間轉運發生(shēng)。PKH67呈綠色熒光(guāng)（見(jiàn)圖1），最大激發波長(cháng)為(wèi)490nm，最大發射波長(cháng)是502nm，與标準熒光(guāng)素（Fluorescein）濾片兼容。PKH67非常适合用于細胞毒性實驗，與碘化丙啶（PI，MX4205）或7-氨基放(fàng)線菌素D（7-AAD，MX4215）這些細胞活力探針聯合使用，或者與橙-紅(hóng)色熒光(guāng)探針比如藻紅(hóng)蛋白(bái)（PE，MX4698）、紅(hóng)色熒光(guāng)蛋白(bái)（RFP）等結合使用。根據染料稀釋原理，PKH67常用于細胞增殖監測分析，包括抗原特異性的前體頻率和帶幹細胞特性的靜(jìng)息/緩慢(màn)分化腫瘤細胞的鑒定。也能(néng)用于監測外泌體或脂質體吞噬，細胞-細胞膜轉運、吞噬、抗原遞呈，以及體内細胞運輸研究。

以不分裂細胞為(wèi)研究對象，通(tōng)過對體外細胞膜滞留周期和體内熒光(guāng)強度減弱頻率的關聯性分析，預測PKH67的體内熒光(guāng)半衰期為(wèi)10-12天。這與PKH1和PKH2的體内半衰期相(xiàng)近，這兩個(gè)探針都成功用于監測周期長(cháng)達1-2個(gè)月(yuè)的體内淋巴細胞和巨噬細胞運輸研究，因此，PKH67适用于需要綠色熒光(guāng)細胞連接染料的短-中期體内示蹤研究，以及體外細胞毒性、吞噬、增殖、抗原遞呈，或其它共培養實驗。

稀釋液C（Diluent C）是本試劑盒配套提供的一(yī)種水(shuǐ)溶性溶液，特别設計的一(yī)種标記媒介能(néng)維持細胞活力，同時最大化染料溶解性和标記過程中的染色效率。Diluent C對哺乳動物(wù)細胞來說是等滲的，不含去污劑或有機(jī)溶劑，也不含生(shēng)理鹽和緩沖劑。根據細胞類型，染料标記後膜的内在化程度，标記細胞可能(néng)呈現不同的狀态，從(cóng)明亮，到(dào)均勻點狀或斑駁狀。然而，PKH67熒光(guāng)在生(shēng)理範圍内不依賴于pH，且每個(gè)細胞的熒光(guāng)強度通(tōng)常不受染料位置的影響。

圖1. PKH67的激發和發射光(guāng)譜圖

我司（懋康生(shēng)物(wù)）提供三種規格的PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜标記），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4023-100UL）建議用于小(xiǎo)量或初步研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測25次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次），和足量的Diluent C用于5次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化确定最佳的染料濃度。

Midi Kit（CAT#：MX4023-200UL）适用于中量研究，比如體外細胞增殖或毒性研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測50次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化确定最佳的染料濃度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）适用于大量或體内研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測125次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個(gè)細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化确定最佳的染料濃度。

産品包裝

保存與運輸方法

保存：2-8ºC避光(guāng)保存，1年(nián)有效。其中組分A（PKH67 Dye）需嚴格避光(guāng)，蓋子保持擰緊。

運輸：冰袋運輸。

注意事(shì)項

1. PKH67是以溶于乙醇的儲存液形式提供，保存的過程中需避光(guāng)并擰緊蓋子，以防止溶液揮發引起的染料濃度提高(gāo)。使用前需檢查是否有結晶，若有結晶，需在37℃水(shuǐ)浴溶晶，超聲或渦旋直至完全溶解。

2. Diluent C使用前需置于室溫回溫之後再配制标記用的細胞和染料工(gōng)作液。Diluent C是無菌溶液，不含任何防腐劑或抗生(shēng)素，使用和保存過程中都注意無菌。

3. PKH67不能(néng)保存在Diluent C内，保存在Diluent C的染色工(gōng)作液需在使用前配制，現配現用。

4. 熒光(guāng)染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光(guāng)，以減緩熒光(guāng)淬滅。

5. 為(wèi)了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一(yī)次性手套操作。

操作步驟

1. 自(zì)行準備儀器(qì)和試劑（試劑盒不提供，用于常規細胞膜标記）

﹒良好分散，均勻的單細胞懸液（懸浮于組織培養基）

﹒含血清的組織培養基（完全培養基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培養基，或生(shēng)理鹽溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白(bái)蛋白(bái)或其他系統兼容的蛋白(bái)

﹒聚丙烯錐底離心管（4-15ml）

﹒能(néng)控溫的離心機(jī)（高(gāo)達1000×g）

﹒熒光(guāng)分析用儀器(qì)（熒光(guāng)酶标闆，熒光(guāng)或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）

﹒無菌層流淨化罩

﹒血球計數闆或自(zì)動細胞計數裝置

﹒載玻片和蓋玻片

2. 常規細胞膜标記

【染色流程】：

以下(xià)操作流程使用2ml最終染色體積，含2μM PKH67，以及1×107個(gè)細胞/ml。

以下(xià)所有步驟都在室溫下(xià)進行（20-25℃）。

1. 取一(yī)錐底聚丙烯離心管制備2×107個(gè)細胞的單細胞懸浮液，用無血清培養基清洗細胞一(yī)次。

2. 400×g離心細胞5min，得到(dào)松散的細胞沉澱。

3. 細胞離心後，輕輕吸掉上(shàng)清。注意不要移動任何細胞并且殘留不超過25μl上(shàng)清液。

4. 加1ml Diluent C到(dào)細胞沉澱中制備成2×細胞懸液，用槍輕輕吹勻以确保完全分散。不可渦旋和不可讓細胞長(cháng)期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制備2×染色液（4μM in Diluent C）：通(tōng)過将4μl PKH67乙醇儲存液到(dào)1ml Diluent C中，充分混勻分散所得。

6. 快速加1ml2×細胞懸液（Step 1.4）到(dào)1ml2×染色液（Step 1.5），用槍立即混勻樣本。混勻後樣本得到(dào)的終濃度是1×107個(gè)細胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的細胞/染料懸液孵育1-5min，中間定期混合。染色過程非常快，更長(cháng)時間無任何益處。

8. 加入等體積（2ml）血清或其他适當蛋白(bái)溶液（比如1% BSA）終止染色，孵育1min允許結合多(duō)餘的探針。

9. 20-25℃，400×g離心細胞10min，輕輕吸掉上(shàng)清，确保不會(huì)移動細胞。用10ml完全培養基重懸細胞，轉移到(dào)一(yī)個(gè)幹淨無菌的錐底聚丙烯離心管中，20-25℃，400×g離心細胞5min。然後用10ml完全培養基清洗細胞沉澱＞2次，以确保完全去除未結合染料。

10. 最後一(yī)步清洗後，用10ml完全培養基重懸細胞沉澱，用來評估細胞回收，細胞活力和染色強度。離心和重懸沉澱到(dào)一(yī)理想終濃度的活細胞懸液。

染色示例（來自(zì)文獻資源）

1）文獻來源：Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的（MKBIO）：為(wèi)了評估旁觀者凋亡效應，靶向THP-1單核細胞用PKH67來标記，最終在熒光(guāng)顯微鏡觀察以确認标記是否成功。标記好的THP-1細胞（未感染的旁觀者細胞量：0.5 × 105cells/ml），加入被H37Ra感染的THP-1巨噬細胞（感染效應細胞量：0.5 × 105cells/ml），接種到(dào)2孔的LabTek腔室玻片。效應巨噬細胞經H37Ra感染4h，之後劇烈清洗去除胞外細菌。之後與未感染的PKH67标記旁觀者細胞共培養，37℃共培養24或48h。孵育後，上(shàng)清液去除，細胞用2% PFA固定，然後用TUNEL TMR監測凋亡，細胞核用Hochest 33342複染。用熒光(guāng)顯微鏡來評估綠色PKH67标記巨噬細胞的旁觀凋亡效應。當某一(yī)個(gè)單細胞同時呈綠色（旁觀者）和紅(hóng)色（凋亡），表明旁觀者凋亡效應的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2）文獻來源：Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的（MKBIO）：50ul肝素化全血用TLR-ligands和細胞因子刺激30min，之後，将1 × 106PKH67标記好的凋亡自(zì)體中性粒細胞加入全血中，置于37℃孵育。60min之後，紅(hóng)細胞用裂解液裂解掉，流式細胞術(shù)觀察中性粒細胞内凋亡細胞的吞噬水(shuǐ)平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50 μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30 min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60 min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

相(xiàng)關産品

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